兩種白細(xì)胞功能異常疾病的臨床分子特征及機(jī)制研究.pdf

1、第一部分慢性肉芽腫病患兒臨床與分子特征研究
　　目的：
　　探討26例慢性肉芽腫病（CGD）患兒的臨床特征，實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果及基因突變特征。
　　方法：
　　1．收集2015年6月-2017年2月在重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院收治的26例CGD患兒臨床資料和實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果并分析總結(jié)。
　　2．流式細(xì)胞術(shù)分析患兒中性粒細(xì)胞呼吸爆發(fā)功能，并計(jì)算中性粒細(xì)胞氧化指數(shù)NOI（刺激后平均熒光強(qiáng)度/刺激前平均熒光強(qiáng)度）。

2、>　　3．PCR直接測(cè)序法分析患兒 CGD相關(guān)基因（CYBB、CYBA、NCF1、NCF2）。
　　結(jié)果：
　　1．一般情況：26例患兒均為男性，15例（57.7%）來自我國(guó)西南地區(qū)，平均起病年齡2.3月，平均診斷年齡1.4歲，14例（53.8%）有家族史（男性親屬早年夭折）。
　　2．臨床表現(xiàn)：26例患兒均有反復(fù)發(fā)熱，肺炎（24例，92.3%）、腹瀉（13例，50%）、皮膚黏膜及皮下組織感染（14例，53.8%）、肝

3、脾腫大、肝功能異常（12例，46.2%）為本組患兒最常見的臨床表現(xiàn)。21例接種卡介苗的患兒中14例（66.7%）發(fā)生BCG接種異常反應(yīng)（卡疤化膿、BCG淋巴結(jié)炎、肺結(jié)核）。此外，3例（11.5%）發(fā)生肝膿腫，2例（7.7%）常患尿路感染
　　3．實(shí)驗(yàn)室檢查：本組患兒多出現(xiàn)外周血白細(xì)胞總數(shù)增高，以中性粒細(xì)胞為主，多有CRP增高。淋巴細(xì)胞分類未見明顯異常，免疫球蛋白正?；虼鷥斝栽龈?，其中9例（34.6%）出現(xiàn)IgE明顯增高。除2例患兒

4、NBT正常外，其余21例（80.8%）NBT均明顯降低，多數(shù)PMA刺激后為0。僅50%患兒找到致病病原菌。
　　4．呼吸爆發(fā)試驗(yàn)及基因突變分析：患兒 NOI多數(shù)低于2（1.365±0.1018），明顯低于正常值（正常人>100），患兒母親 NOI正?；虻陀谡Ｖ担?1例（80.8%）患兒發(fā)現(xiàn) CYBB基因突變，1例（3.8%） CYBA突變，4例（15.4%）尚未明確致病基因，發(fā)現(xiàn)15名XLR-CGD攜帶者。
　　結(jié)論:

5、r>　　CGD患兒多于生后即發(fā)生嚴(yán)重的細(xì)菌及真菌感染，患兒伴有BCG接種異常反應(yīng)及男性親屬早年夭折家族史，白細(xì)胞總數(shù)顯著增高，以中性粒細(xì)胞為主，NBT異常，免疫球蛋白正常或升高，則需警惕CGD。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)中性粒細(xì)胞呼吸爆發(fā)功能可快速診斷CGD，基因檢測(cè)可進(jìn)一步確診患者、發(fā)現(xiàn)攜帶者，有產(chǎn)前診斷意義。
　　第二部分慢性肉芽腫病患兒記憶B細(xì)胞減少的相關(guān)因素研究
　　目的:
　　探討CGD患兒是否存在外周血記憶B細(xì)胞（MB

6、C）減少的現(xiàn)象，尋找其減少的原因；并探索IFN-γ治療CGD患兒，減少反復(fù)感染的可能機(jī)制，為臨床運(yùn)用IFN-γ治療和預(yù)防反復(fù)感染提供理論依據(jù)。
　　方法:
　　1．流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè) CGD患兒 MBC百分比、CD4+T細(xì)胞表面CD40L表達(dá)量、Tfh細(xì)胞及其表面PD-1百分比。
　　2．不同濃度 sCD40L（1μg/ml、1.5μg/ml、2μg/ml）與正常兒童外周血PBMC共同刺激培養(yǎng)24h、36h、48h，流式細(xì)

7、胞術(shù)檢測(cè)MBC數(shù)量的變化。
　　3．分別用不同濃度的外源性H2O2（10μmol/L、30μmol/L）、IFN-γ（2000U/ml、3000U/ml）與 CGD患兒外周血 PBMC共同刺激培養(yǎng)24h，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)MBC數(shù)量的變化。
　　結(jié)果:
　　1．CGD患兒 MBC百分比(1.267%±0.1416%)較健康對(duì)照兒童（2.824%±0.27%）明顯降低（P＜0.0001）。
　　2．CGD患兒CD4+T

8、細(xì)胞表面CD40L百分比（8.186%±2.736%）較健康對(duì)照兒童（46.43%±4.619%）明顯降低（P＜0.0001）。
　　3．CGD患兒外周血 Tfh細(xì)胞(5.625%±0.5005%)與健康兒童(6.269%±1.177%)無顯著差異(P=0.5614)。PD-1百分比（9.039%±1.984%）與健康兒童（18.26%±10.11%）無顯著差異(P=0.7546)。
　　4．外源性補(bǔ)充sCD40L不能促進(jìn)健

9、康兒童MBC增高，MBC百分比隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)逐漸降低（P=0.0028）。
　　5．外源性補(bǔ)充H2O2、IFN-γ對(duì)CGD患兒MBC無明顯刺激作用，相反，MBC百分比隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)逐漸降低（P＜0.0001）。
　　結(jié)論:
　　CGD患兒外周血MBC減少可能是患兒反復(fù)感染的原因，MBC減少可能與CD4+T細(xì)胞表面CD40L表達(dá)減少相關(guān)，雖然CGD患兒外周血Tfh細(xì)胞數(shù)量正常，但仍需進(jìn)一步分析Tfh細(xì)胞表面CD40L表達(dá)

10、情況以明確Tfh細(xì)胞功能是否正常。IFN-γ并不通過刺激CGD患兒外周血MBC增殖發(fā)揮治療作用。
　　第三部分3例白細(xì)胞黏附分子缺陷病Ι型的臨床及分子特征分析
　　目的:
　　探討3例白細(xì)胞黏附分子缺陷病Ι型（LAD-1）患兒的臨床特征和CD18蛋白表達(dá)異常及基因突變特征。
　　方法:
　　1．總結(jié)3例患兒臨床資料，常規(guī)免疫學(xué)篩查除外常見原發(fā)性免疫缺陷病。
　　2．流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)白細(xì)胞表面CD18分子

11、。
　　3．PCR測(cè)序分析患兒及其父母ITGB2基因。
　　結(jié)果:
　　1．臨床表現(xiàn)：患兒均自新生兒起以臍炎起病，之后經(jīng)歷反復(fù)皮膚黏膜及軟組織感染（肺炎、中耳炎、鵝口瘡、牙齦炎伴乳牙早脫），其中2例（例1、例2）有臍帶脫落延遲史（>21天），2例（例1、例3）有慢性皮膚感染及傷口愈合延遲（>1月），1例（例1）家族中有早年夭折患兒。
　　2．實(shí)驗(yàn)室檢查：患兒均有外周血白細(xì)胞總數(shù)顯著增高，以中性粒細(xì)胞為主，因反復(fù)感

12、染，常伴有貧血，免疫球蛋白IgG、IgA、IgM增高，淋巴細(xì)胞分類、NBT無明顯異常。
　　3．CD18流式分析：患兒白細(xì)胞表面 CD18分子表達(dá)明顯降低，例2為重度缺陷（CD18在淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞上分別為0、0.23%、0），例1、例3為中度缺陷（例1：9.49%、0.04%、0.45%；例3：10.14%、0.67%、2.54%），但所有父母CD18表達(dá)均>90%。
　　4． ITGB2基因分析：發(fā)現(xiàn)5種突

13、變位點(diǎn)（c.167_168insGG、c.1884C>A、c.533C>T、c.817G>C、c.1768T>C），其中2種為新型突變（例1 c.167-168insGG、c.1884C>A），并發(fā)現(xiàn)5名攜帶者。
　　結(jié)論:
　　自幼反復(fù)嚴(yán)重皮膚黏膜及軟組織感染，尤其伴有臍炎、臍帶脫落延遲，傷口愈合延遲，反復(fù)牙齦炎伴乳牙早脫，白細(xì)胞總數(shù)顯著增高，以中性粒細(xì)胞為主，伴免疫球蛋白正?；蛏叩幕純盒杈?LAD-1。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)