PICK1蛋白PDZ結(jié)構(gòu)域內(nèi)K83位點(diǎn)對PICK1與GluR2相互作用的影響.pdf

1、背景和目的:PICK1是近年發(fā)現(xiàn)的能調(diào)控AMPA受體轉(zhuǎn)運(yùn)的蛋白,具體調(diào)控機(jī)制尚不明確。PDZ結(jié)構(gòu)域是公認(rèn)的蛋白-蛋白相互作用組件,根據(jù)他們結(jié)合的PDZ結(jié)合域(PDZ配體)的不同可分為三種類型,而PICK1PDZ結(jié)構(gòu)域既可以與Ⅰ型PDZ配體結(jié)合又可以與Ⅱ型PDZ配體相結(jié)合。它的這種特性主要是依賴于αB1上的賴氨酸(K83),K83使得PICK1既可以滿足Ⅰ型PDZ配體與PDZ結(jié)構(gòu)域形成氫鍵的需要,又可以滿足Ⅱ型PDZ配體形成疏水鍵的需要。

2、因此83位點(diǎn)是一個(gè)非常特殊的氨基酸位點(diǎn)。為了研究PICK1PDZ結(jié)構(gòu)域與GluR2C末端相互作用中K83位點(diǎn)所起的作用,我們首先利用計(jì)算機(jī)對83位點(diǎn)進(jìn)行剩余19個(gè)氨基酸的模擬點(diǎn)突變,接著對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析并結(jié)合PDZ結(jié)構(gòu)域分類理論及氨基酸結(jié)構(gòu)確定纈氨酸(V)、組氨酸(H)、丙氨酸(A)及谷氨酸(E)為重點(diǎn)研究對象,再經(jīng)實(shí)驗(yàn)生物學(xué)去驗(yàn)證。這種生物信息學(xué)與實(shí)驗(yàn)生物學(xué)結(jié)合的方法也可以為今后解決蛋白間相互作用問題提供新的研究思路。
　　 實(shí)

3、驗(yàn)方法:1、質(zhì)粒的構(gòu)建:利用實(shí)驗(yàn)室已有GFP標(biāo)記的野生型全長PICK1cDNA序列,設(shè)計(jì)突變引物,PCR擴(kuò)增引入突變,然后用DpnI酶切去除沒有突變的模板質(zhì)粒,最后測序確認(rèn)突變體構(gòu)建成功。2、HEK293T細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染:HEK293T細(xì)胞用含有10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng),每3天傳代一次。細(xì)胞接種于60mm直徑的培養(yǎng)皿或預(yù)先放置載玻片的12孔板,然后采用磷酸鈣沉淀法轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞。3、免疫細(xì)胞化學(xué)染色和熒光成像分析:長在

4、玻片上的細(xì)胞固定后用0.2％TritonX-100透膜10分鐘然后用特異性一抗和熒光二抗做全細(xì)胞染色,觀察PICK1與GluR2共定位的改變。免疫細(xì)胞化學(xué)染色后的觀察,共集簇?cái)?shù)目等分析使用OLYMPUS激光共聚焦掃描顯微鏡。
　　 結(jié)果:1.當(dāng)野生型PICK1與GIuR2共轉(zhuǎn)染時(shí),HEK293T細(xì)胞有大量PICK1cluster,且這些PICK1cluster與GluR2共定位。當(dāng)我們把構(gòu)建的PICK1突變體單獨(dú)與GluR2共轉(zhuǎn)

5、染時(shí),不同的突變體表現(xiàn)出不一樣的改變,將GFP-PICK1K83V和GFP-PICK1K83H分別與GluR2共轉(zhuǎn)染,含有PICK1cluster的細(xì)胞與野生型轉(zhuǎn)染相比沒有顯著差異;將GFP-PICK1K83A與GIuR2共轉(zhuǎn)染,含有PICK1cluster的細(xì)胞有所減少;將GFP-PICK1K83E與GIuR2共轉(zhuǎn)染,含有PICK1duster的細(xì)胞數(shù)目顯著減少。
　　 結(jié)論:PICK1PDZ結(jié)構(gòu)域上的K83位點(diǎn)對于PICK1