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文檔簡介
1、細(xì)胞凋亡(Apoptosis)是多細(xì)胞生物中重要的生物學(xué)過程,具有影響組織分化、新陳代謝及免疫調(diào)節(jié)等多方面功能。在細(xì)菌引起的感染性疾病中,細(xì)菌的特定組分可以通過多種途徑調(diào)控宿主細(xì)胞的凋亡,而這也被證實(shí)對疾病的進(jìn)程有著至關(guān)重要的影響。
金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)作為重要的人類病原菌,在其感染過程中也可引起宿主細(xì)胞凋亡。在許多與金黃色葡萄球菌密切相關(guān)的疾病,如特應(yīng)性皮炎(Atopic Dermat
2、itis,AD)和膿毒癥(sepsis)中,異常的宿主細(xì)胞凋亡現(xiàn)象可顯著影響疾病的進(jìn)程、嚴(yán)重程度和預(yù)后。金黃色葡萄球菌的一個重要特點(diǎn)是其可分泌多種毒素,包括溶血素、殺白細(xì)胞素、腸毒素及分泌酶等。其中腸毒素是一種重要的金黃色葡萄球菌超抗原,在很多與金黃色葡萄球菌密切相關(guān)的疾病中發(fā)揮著重要的作用。腸毒素的天然受體包括T細(xì)胞受體(TCR)和主要組織相容性復(fù)合體Ⅱ類分子(major histocompatibility complexⅡ,MHC
3、Ⅱ),金葡菌腸毒素結(jié)合TCR可持續(xù)激活T細(xì)胞引起超敏反應(yīng);而結(jié)合MHICⅡ則具有促細(xì)胞凋亡作用。在腸毒素家族中,金黃色葡萄球菌腸毒素B(staphylococcal enterotoxin B,SEB)分布較廣、研究也較為深入。SEB已被證實(shí)能夠引起T細(xì)胞和外周血單核細(xì)胞(PBMC)凋亡,且這種細(xì)胞凋亡與金黃色葡萄球菌引起的疾病,如AD等密切相關(guān)。但SEB是否能引起單核-巨噬細(xì)胞凋亡,以及其分子機(jī)制目前仍不清楚。
本研究從我室
4、分離并完成全基因組測序的金黃色葡萄球菌XQ株基因組中克隆、表達(dá)并純化了具有生物學(xué)活性的重組SEB蛋白,開展了SEB引起THP-1單核-巨噬細(xì)胞凋亡的作用及其機(jī)制研究,發(fā)現(xiàn)了一個依賴于TNFα的正反饋回路在此過程中起到非常重要的作用;同時發(fā)現(xiàn)金屬硫蛋白2A(metallothionein2A,MT2A)可通過促進(jìn)SEB引起的TNFα表達(dá)上調(diào),從而促進(jìn)TNFα正反饋回路的形成,在SEB引起THP-1細(xì)胞凋亡的過程中具有重要地位。所得研究結(jié)果
5、為將來深入闡明金黃色葡萄球菌腸毒素的作用機(jī)制以及宿主細(xì)胞應(yīng)對毒素攻擊的機(jī)制提供了重要參考。本論文的主要研究方法和結(jié)果如下:
1.重組SEB蛋白的表達(dá)載體構(gòu)建、表達(dá)與純化
以金黃色葡萄球菌XQ株全基因組為模板,利用PCR技術(shù)獲得SEB編碼序列,再通過BamHⅠ+XhoⅠ雙酶切以及采用T4連接酶與表達(dá)載體連接,成功構(gòu)建了表達(dá)質(zhì)粒pET30a-SEB。將表達(dá)質(zhì)粒pET30a-SEB轉(zhuǎn)化入表達(dá)菌株大腸埃希菌C43后,成功誘導(dǎo)
6、表達(dá)出重組SEB蛋白。
表達(dá)的重組SEB蛋白經(jīng)過鎳柱親和層析純化后,利用去內(nèi)毒素凝膠柱去除內(nèi)毒素、超濾柱濃縮并置換緩沖液為PBS緩沖液,最終以SDS-PAGE測定重組蛋白純度、Bradford法測定蛋白質(zhì)濃度及鱟試劑反應(yīng)實(shí)驗(yàn)檢測殘留內(nèi)毒素,結(jié)果重組SEB蛋白的純度在95%以上,濃度為539.2μg/ml,毒素含量低于2EU/ml,滿足后續(xù)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)要求。
2.重組SEB蛋白具有引起THP-1細(xì)胞凋亡的作用
委
7、托北京閱微基因技術(shù)有限公司對獲贈的THP-1細(xì)胞系進(jìn)行STR檢測,細(xì)胞中沒有發(fā)現(xiàn)人類細(xì)胞交叉污染,與美國模式培養(yǎng)物保存中心(American type culturecollection,ATCC)中THP-1細(xì)胞的STR數(shù)據(jù)匹配率為93.33%,證實(shí)我們的細(xì)胞系為THP-1的衍生細(xì)胞系。
利用AnnexinⅤ+PI雙染色及流式細(xì)胞分析,確定了重組SEB蛋白具有引起THP-1細(xì)胞凋亡作用,細(xì)胞凋亡比例約為3%,并且具有時間和劑
8、量依賴效應(yīng)。利用廣譜caspase抑制劑Z-VAD-FMK,證實(shí)重組SEB蛋白引起的THP-1細(xì)胞凋亡依賴caspase的級聯(lián)激活。
在IFN-γ激活及PMA誘導(dǎo)分化后的THP-1細(xì)胞中,利用AnnexinⅤ+PI雙染色及流式細(xì)胞分析,檢測到重組SEB蛋白引起的細(xì)胞凋亡比例更高,分別約為7.5%和15%。內(nèi)毒素激活THP-1細(xì)胞后并不增強(qiáng)重組SEB蛋白引起THP-1細(xì)胞凋亡的作用。然而IFN-γ激活和PMA誘導(dǎo)分化后,陰性對照
9、組中THP-1細(xì)胞凋亡也有所上升。為避免額外因素的干擾,在接下來的研究中均直接使用重組SEB蛋白作用于THP-1細(xì)胞而不再進(jìn)行額外的細(xì)胞激活或誘導(dǎo)分化。
3.重組SEB蛋白引起THP-1細(xì)胞凋亡依賴于一個TNFα的正反饋回路
經(jīng)典的細(xì)胞凋亡包括外源性(caspase8激活)和內(nèi)源性(caspase9激活)兩條途徑,通過caspase-3,-8,-9活性檢測試劑盒對重組SEB蛋白作用后的TPH-1細(xì)胞之相應(yīng)酶活性檢測發(fā)
10、現(xiàn),重組SEB蛋白引起的THP-1細(xì)胞凋亡依賴caspase-3和-8的激活而不依賴caspase-9的激活,說明外源性通路在SEB引起THP-1細(xì)胞凋亡過程中發(fā)揮重要作用。
利用RT-qPCR檢測重組SEB蛋白處理后THP-1細(xì)胞中凋亡相關(guān)分子的轉(zhuǎn)錄水平,結(jié)果發(fā)現(xiàn)重組SEB蛋白處理后,THP-1細(xì)胞中TNFα和HLA-DRa的轉(zhuǎn)錄水平顯著升高。進(jìn)一步利用ELISA和Western blot實(shí)驗(yàn),證實(shí)了重組SEB蛋白在THP-
11、1細(xì)胞中引起的TNFα和HLA-DRa表達(dá)升高。
利用anti-TNFα單克隆抗體中和TNFα作用后,檢測到重組SEB蛋白引起的THP-1細(xì)胞凋亡比例下降至約1%,與重組SEB蛋白直接作用后的3.5%存在顯著差異,而同型對照抗體則無此作用,證實(shí)TNFα在SEB引起的THP-1細(xì)胞凋亡過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。
利用siRNA干擾HLA-DRa和TNFR1的表達(dá),發(fā)現(xiàn)在干擾后的THP-1細(xì)胞中,重組SEB蛋白引起的凋亡細(xì)胞比
12、例(約2.5%)顯著低于用無目標(biāo)siRNA干擾的對照組細(xì)胞(約9%)。同時,HLA-DRa和TNFR1siRNA干擾的THP-1細(xì)胞在重組SEB蛋白作用后,TNFα分泌水平也顯著低于無目標(biāo)siRNA干擾的對照組細(xì)胞。而TNFα本身又會上調(diào)HLA-DRa的表達(dá),從而增加了重組SEB蛋白與HLA-DRa的結(jié)合,使得TNFα的分泌進(jìn)一步增加,于是形成了一個依賴于TNFα的正反饋回路。重組SEB蛋白引起的THP-1細(xì)胞凋亡依賴于這一正反饋回路的
13、形成和完整。
4.MT2A通過促進(jìn)TNFα的正反饋回路從而促進(jìn)重組SEB蛋白引起的THP-1細(xì)胞凋亡
作為SEB的受體,THP-1細(xì)胞的HLA-DRa僅有的胞質(zhì)區(qū)僅含15個氨基酸殘基,且不含任何已知的結(jié)構(gòu)域,HLA-DRa與SEB結(jié)合后,后續(xù)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)很可能依靠與HLA-DRa直接結(jié)合的其他膜蛋白來實(shí)現(xiàn)。且SEB結(jié)合HLA-DRa以后如何上調(diào)TNFα的表達(dá)機(jī)制也不清楚。利用免疫共沉淀技術(shù),通過anti-HLA-DRa
14、單克隆抗體去捕捉與HLA-DRa相互作用的蛋白質(zhì),發(fā)現(xiàn)了一個金屬硫蛋白(metallothioneins,MTs)MT2A可能參與了SEB引起的THP-1細(xì)胞凋亡作用過程。
利用RT-qPCR分析了THP-1細(xì)胞中MTs的表達(dá)譜及其在重組SEB蛋白作用后轉(zhuǎn)錄水平的改變,結(jié)果發(fā)現(xiàn)THP-1細(xì)胞中表達(dá)的MTs包括MT1E、F、G、X和MT2A,在重組SEB蛋白作用后,僅MT2A表達(dá)上升。Western blot實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)了重組
15、SEB蛋白作用后THP-1細(xì)胞中MT2A的表達(dá)上升約50%。利用AnnexinⅤ+PI雙染色及流式細(xì)胞分析,發(fā)現(xiàn)在siRNA干擾MT2A表達(dá)的THP-1細(xì)胞中,重組SEB蛋白作用后的細(xì)胞凋亡比例(約4%)明顯少于無目標(biāo)siRNA干擾的對照組細(xì)胞(約8%)。利用ELISA和Western blot實(shí)驗(yàn),進(jìn)一步檢測到在siRNA干擾MT2A表達(dá)的THP-1細(xì)胞中,重組SEB蛋白作用后TNFα和HLA-DRa表達(dá)水平均降低,說明MT2A通過促
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