類芽孢桿菌屬菌株產(chǎn)生淀粉酶的分離純化及對(duì)淀粉結(jié)合域CBM25的初步研究.pdf

1、由于近年來(lái)石油價(jià)格不斷攀升，各個(gè)國(guó)家和實(shí)驗(yàn)室都在尋找高效的可再生能源來(lái)取代石油這一高耗費(fèi)的能源，比如利用木薯、馬鈴薯淀粉等來(lái)生產(chǎn)燃料乙醇。工業(yè)上，淀粉轉(zhuǎn)變?yōu)槠咸烟切枰?jīng)過液化和糖化兩個(gè)步驟，這就要求對(duì)淀粉原料進(jìn)行高溫蒸煮?；跍p少能源消耗和有效利用天然資源的原則，廣大科研人員特別關(guān)注生淀粉的生物能轉(zhuǎn)化過程，并對(duì)能降解生淀粉的酶類進(jìn)行研究。
　　 本研究通過多次連續(xù)富集培養(yǎng)，從廣西武鳴縣某淀粉廠附近篩選分離到一株具有較強(qiáng)水解生淀粉

2、能力的細(xì)菌，該菌株革蘭氏染色陽(yáng)性，細(xì)胞呈桿狀，芽孢為橢圓形。經(jīng)過16SrDNA序列分析，初步鑒定該菌株為類芽孢桿菌屬Paenibacillussp.，命名為Paenibacillussp.WN61。該菌株液體搖瓶發(fā)酵70h后，生淀粉酶活力達(dá)到108.5U/mL，RDA值為57.8％，對(duì)木薯生淀粉的吸附率為70.26％，表現(xiàn)出對(duì)生淀粉具有較強(qiáng)的降解能力。
　　 通過飽和(NH4)2S04沉淀、SephacrylS-300層析的方法

3、對(duì)Paenibacillussp.WN61所產(chǎn)的生淀粉酶進(jìn)行分離純化，得到純化的酶蛋白比活力為5112.04U/mg，純化倍數(shù)為14.1，相對(duì)分子質(zhì)量約為100kDa。該酶以木薯生淀粉為底物時(shí)，最適pH值為5.6，最適溫度為50℃。金屬離子Ca2+、Mg2+對(duì)該酶具有激活作用，Zn2+、Cu2+、Fe2+、Ni2+、Mnz+、C02+和EDTA對(duì)該酶均具有抑制作用。以可溶性淀粉為底物時(shí)，該酶的Km值為0.9059mg/mL，Vmax為2

4、59.0umol/mL·min。利用高效液相色譜分析其水解產(chǎn)物，包括麥芽糖、葡萄糖和麥芽三糖，推測(cè)該生淀粉酶是一種a-淀粉酶。
　　 在各種淀粉酶中，大約只有10％的淀粉酶能結(jié)合并降解生淀粉，它們通常具有一個(gè)明顯的序列結(jié)構(gòu)模塊，即淀粉結(jié)合域(SBD)。CBM25是淀粉結(jié)合域中的一類。從土壤富集宏基因組DNA中擴(kuò)增到不包含和包含淀粉結(jié)合域CBM25的B.polymyxaβ-淀粉酶基因，并成功表達(dá)至pSE380載體上，獲得重組質(zhì)粒p

5、SE380-B-amy1和pSE380-B-amy2，以大腸桿菌BL21(DE3)為宿主細(xì)胞大量表達(dá)融合的蛋白。利用鎳離子親和層析柱對(duì)BL21（DE3)/pSE380-B-amy1和BL21(DE3)/pSE380-B-amy2表達(dá)的重組蛋白進(jìn)行純化，SDS-PAGE凝膠電泳表明獲得的純化蛋白相對(duì)分子質(zhì)量分別為46kDa和68kDa。酶學(xué)性質(zhì)研究表明，它們的最適溫度均為50℃，最適pH值均為7.0。B-AMY1的Km、Vmax和比活力分