miR-365靶向下調(diào)BAX抑制凋亡促進皮膚鱗狀細胞癌發(fā)生發(fā)展的初步研究.pdf

1、目的:
　　非黑色素瘤皮膚癌(Non-melanoma skin cancer，NMSC)是人類常見的惡性腫瘤之一，包括基底細胞癌(Basal cell carcinoma，BBC)和鱗狀細胞癌(squamouscell carcinoma of skin，SCC)等。SCC是源于上皮組織中角質(zhì)形成細胞的惡性腫瘤，包括宮頸癌、食道癌和皮膚鱗狀細胞癌等(squamous cell carcinoma of skin，CSCC)。CS

2、CC是發(fā)生在表皮（或粘膜）上皮細胞的一種惡性腫瘤，它的發(fā)病率低于基底細胞癌，但是轉(zhuǎn)移率和死亡率較高，男性發(fā)病多于女性，好發(fā)于臉部、手部和前臂。已有的報道m(xù)icroRNAs參與CSCC發(fā)生發(fā)展。microRNA(miRNA)是一類由內(nèi)源基因編碼的長度約為22個核苷酸的非編碼單鏈RNA小分子，microRNA與靶mRNA的3'UTR部分序列特異性堿基配對，會抑制靶基因的轉(zhuǎn)錄翻譯。不同microRNA在不同的癌癥中表達不同，同一個microR

3、NA在不同的癌癥表達也存在著差異，例如miR-365在CSCC及原發(fā)性乳腺癌中表達上調(diào)，而miR-365在胃癌、非小細胞肺癌、肝癌及黑色素細胞瘤卻表達下調(diào)。已知多種microRNA可調(diào)控BAX表達。BAX屬于BCL-2家族中的促凋亡蛋白，BAX蛋白的過表達、低表達和活化都會導致腫瘤生物學功能的改變。本課題的研究目的是探討miR-365在CSCC中的生物學作用，進一步明確miR-365與BAX分子之間的調(diào)控機制，為CSCC的臨床治療提供理

4、論依據(jù)和新的治療策略。
　　方法:
　?、俨捎胵PCR的方法檢測人永生化表皮細胞與CSCC細胞系、人正常表皮組織與人皮膚鱗癌組織以及裸鼠移植瘤中miR-365和BAX的表達，采用WesternBlot檢測BAX在蛋白水平上的表達;②免疫組化檢測人正常表皮組織與人皮膚鱗癌組織以及裸鼠移植瘤中的BAX表達;③雙熒光素酶實驗等檢測miR-365與BAX之間的靶向調(diào)控關系;④使用CCK8法、細胞劃痕實驗、細胞遷移實驗和侵襲實驗檢測A

5、431細胞轉(zhuǎn)染NC、siBAX后，細胞的增殖能力、修復能力、遷移運動和侵襲能力的變化;⑤用流式細胞儀檢測A431細胞轉(zhuǎn)染NC、siBAX后，對細胞凋亡的影響;⑥Tunnel實驗檢測皮下移植瘤細胞中的凋亡情況。
　　結果:
　?、倥c對照相比，miR-365在CSCC細胞系中高表達(P＜0.001)，BAX在mRNA水平以及蛋白水平低表達(P＜0.001)。②CSCC組織中，與正常表皮組織相比，BAX在mRNA水平以及蛋白水平低

6、表達(p＜0.01)。免疫組化中BAX的陽性率低于正常表皮組織(P＜0.01)。③雙熒光素酶實驗表明，BAX.3'UTR-WT組的熒光強度明顯低于BAX3'UTR-Mutant組(P＜0.01)。④分別將miR-365minic和antagomiR-365轉(zhuǎn)染至A431細胞。miR-365組中miR-365表達上調(diào)，BAXmRNA水平及蛋白水平表達下調(diào)(P＜0.001);相反，antagomiR-365組中miR-365表達下調(diào)，BAX

7、 mRNA水平及蛋白水平表達上調(diào)(P＜0.001)。⑤轉(zhuǎn)染NC、siBAX至A431細胞中，與對照NC相比，siBAX組細胞的增殖能力(P＜0.001)、修復能力(P＜0.05)、遷移（P＜0.001）及侵襲(P＜0.001)能力均增強，細胞凋亡減少(P＜0.05)。⑥裸鼠皮下成瘤初步實驗揭示，與NC組相比，siBAX處理組的生長速度更快(P＜0.05)，腫瘤體積更大;種植瘤中BAX在mRNA水平和蛋白表達水平均低于對照組;免疫組化中，