歸經(jīng)藥替代，初步探討溫經(jīng)湯溫化寒凝治療原發(fā)性痛經(jīng)的藥理機制.pdf

1、原發(fā)性痛經(jīng)(Dysmenorrhea，PD)發(fā)病率高，臨床流行病學調(diào)查統(tǒng)計與不孕以及婦科腫瘤關系密切。針對臨床常見任脈寒凝血瘀證候，中醫(yī)溫經(jīng)活血治療有優(yōu)勢。溫經(jīng)湯為治療痛經(jīng)任脈寒凝血瘀證的經(jīng)典方劑，前期發(fā)現(xiàn)解偶聯(lián)蛋白4和relaxin2機能異常參與發(fā)病，本研究在此基礎上，通過離體和整體動物模型，選擇增強任脈局部產(chǎn)熱分子效應或/和任脈局部抗血小板聚集效應的單體分子作為機制陽性藥，選擇非任脈歸經(jīng)的溫里藥或/和活血藥，替代任脈歸經(jīng)的溫里藥或/

2、和活血藥，反證寒凝血瘀證“寒凝任脈”的主導病機，確認溫經(jīng)湯“離體實驗抗子宮痙攣，在體藥效為產(chǎn)熱抗凝”的允許作用，尋找發(fā)育致病藥效的靶點信號途徑。
　　實驗一 吳茱萸堿舒張PLCβ-IP3/DAG子宮痙攣模型
　　目的：觀察吳茱萸堿(Evo)對大鼠離體子宮平滑肌的舒張作用及其可能機制。
　　方法：以PGF2α誘導大鼠離體子宮平滑肌收縮，生物機能實驗系統(tǒng)觀察Evo舒張離體子宮平滑肌的作用以及辣椒素受體阻斷劑capsazep

3、ine，磷脂酶Cβ阻斷劑U73122和鈣調(diào)蛋白阻斷劑W-7對吳茱萸堿作用的影響，Prism-5.01非線型可變斜率回歸計算半效濃度。
　　結(jié)果：Evo對PGF2α(EC50=9.60×10-11mol·L-1)收縮離體子宮平滑肌舒張作用的半效濃度9.56×10-9mol·L-1。半抑制濃度的capsazepine(6.30×10-11mol·L-1)，U73122(2.57×10-11mol·L-1)和W-7(5.65×10-13

4、mol·L-1)預舒張離體子宮平滑肌后，Evo EC50降低，量效曲線左移。EC50從小到大為：W-7-Evo(8.88×10-15mol·L-1)＜capsazepine-Evo(7.35×10-13mol·L-1)＜U73122-Evo(1.95×10-12mol·L-1)。W-7增敏Evo舒張子宮約106倍，capsazepine增敏約104倍，U73122增敏約103倍。
　　結(jié)論：Evo可通過阻斷PLCβ-IP3/DAG

5、通路上TRPV1，PLCβ和CaM舒張子宮平滑肌，根據(jù)其靶點效應比較推理，推測其結(jié)合位點為信號通路中CaM下游蛋白。
　　實驗二 溫經(jīng)湯溫化任脈治療原發(fā)性痛經(jīng)藥效
　　目的：探討溫經(jīng)湯溫化任脈治療原發(fā)性痛經(jīng)的藥效。
　　方法：大鼠序貫實施肩胛骨間棕色脂肪切除，d3-d76高脂飼料喂養(yǎng)，d21-d76灌胃已烯雌酚以復制寒凝血瘀證原發(fā)性痛經(jīng)大鼠模型。以維A酸(ATRA)為溫任陽性藥，辣椒素(Cap)為任脈活血陽性藥，d41

6、-d76每天灌胃吳茱萸堿vo)、溫經(jīng)湯(WJD)、山茱萸替代吳茱萸溫經(jīng)湯(SDW)、丹參替代川芎溫經(jīng)湯(DDW)。d69以PGF2α誘導宮腔壓力升高，d77稱量子宮重量計算臟器系數(shù)，HE染色計算子宮肌層與內(nèi)膜體積比;Masson染色計算子宮內(nèi)膜、子宮及子宮頸膠原纖維構(gòu)成比，取血分離血漿檢測丙酮酸(PA)、游離脂肪酸(FFA)、甘油三酯(TG)、膽固醇(TC);催乳素(PRL)，促卵泡素(FSH)，黃體生成素(LH），雌二醇(E2)，孕酮

7、(P)含量。以對照組，模型組，WJD組和Evo組為共用組，①溫化寒凝藥效分析增加ATRA組、SDW組;②活血止疼藥效分析加Cap組、DDW;③非任脈溫里和/或活血藥替代后藥效降低相對值用(ATRT/SDW)和/或(Cap/DDW)表示。數(shù)據(jù)進行效能轉(zhuǎn)換后，t檢驗比較組間差別，P＜0.05為有顯著性意義。
　　結(jié)果：①溫化寒凝藥效：與ATRA比較：WJD組，SDW組，Evo組(P＜0.05)子宮系數(shù)降低;WJD組，SDW組，Evo組

8、(P＜0.05)FFA升高;WJD組(P＜0.05)，SDW組，Evo組(P＜0.01)宮內(nèi)壓降低降低;WJD組(P＜0.05)，SDW組，Evo組子宮內(nèi)膜構(gòu)成比降低;WJD組(P＜0.01)，SDW組，Evo組(P＜0.01)血漿LH降低;WJD組(P＜0.05),SDW組，Evo組血漿E2降低;WJD組(P＜0.05),SDW組(P＜0.05)，Evo組血漿P升高。②活血止疼藥效：與Cap組比較：WJD組，DDW組，Evo組(P＜0

9、.05)子宮系數(shù)降低;WJD組，DDW組，Evo組(P＜0.01)FFA降低;WJD組，DDW組，Evo組(P＜0.01)宮內(nèi)壓降低降低;WJD組(P＜0.05)，DDW組，Evo組子宮內(nèi)膜構(gòu)成比降低;WJD組(P＜0.01)，DDW組，Evo組(P＜0.05)血漿LH降低;WJD組(P＜0.05),DDW組，Evo組血漿E2降低;WJD組，DDW組，Evo組血漿P升高。③溫化寒凝/活血止疼：ATRT/SDW相比于Cap/DDW∶FFA

10、(P＜0.01)，宮腔壓力(P＜0.05），肌層膠原體積比(P＜0.05)，宮頸膠原體積比(P＜0.01)，血漿促卵泡素(P＜0.05)，血漿催乳素(P＜0.05)，血漿E2(P＜0.05)的ATRT/SDW高于Cap/DDW。
　　結(jié)論：原發(fā)性痛經(jīng)寒凝血瘀證的主導病機為任脈之寒，兼顧病機為寒致任脈之瘀。溫經(jīng)湯通過調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝，性激素軸水平（溫化寒凝），通過降低宮內(nèi)壓，改善內(nèi)膜增生（活血止疼）治療痛經(jīng)。
　　實驗三 溫經(jīng)湯溫

11、化任脈治療原發(fā)性痛經(jīng)藥理
　　目的：探討溫經(jīng)湯治療原發(fā)性痛經(jīng)寒凝血瘀證模型大鼠的作用機制。
　　方法：動物造模，分組給藥同實驗二。d77取子宮，采用Elisa測血漿relaxin2含量，免疫組化、實時定量RT-PCR和Western blot法檢測子宮組織內(nèi)UCP4，relaxin2的表達水平。數(shù)據(jù)分析同實驗二。
　　結(jié)果：①溫化寒凝藥理：與ATRT比：WJD組UCP4原位表達升高，SDW組與Evo組UCP4原位表達降

12、低;WJD組(P＜0.05)與Evo組(P＜0.05)UCP4基因表達升高，SDW組(P＜0.01)UCP4基因表達降低;WJD組UCP4蛋白表達升高，SDW(P＜0.05)組與Evo組UCP4蛋白表達降低;WJD組，SDW組，Evo組relaxin2血漿含量升高;WJD組relaxin2原位表達升高，SDW組(P＜0.01)與Evo組(P＜0.01)relaxin2原位表達降低;WJD組，SDW組，Evo組relaxin2基因表達升高

13、;WJD組(P＜0.01)與Evo組relaxin2蛋白表達升高，SDW組(P＜0.01)relaxin2蛋白表達降低。②活血止疼藥理：與Cap組比較：WJD組與Evo組UCP4原位表達升高，DDW組UCP4原位表達降低;WJD組(P＜0.05)與Evo組UCP4基因表達升高，DDW組UCP4基因表達降低;WJD組UCP4蛋白表達升高，DDW組與Evo組UCP4蛋白表達降低;WJD組，DDW組，Evo組relaxin2血漿含量升高;WJ

14、D組(P＜0.01)relaxin2原位表達升高，DDW組(P＜0.01)與Evo組(P＜0.01)relaxin2原位表達降低;WJD組，Evo組relaxin2基因表達升高，DDW組relaxin2基因表達降低;WJD組(P＜0.01)與Evo組relaxin2蛋白表達升高，DDW組relaxin2蛋白表達降低。③溫化寒凝/活血止疼：ATRT/SDW相比于Cap/DDW∶UCP4原位表達(P＜0.05)，基因表達(P＜0.05)，蛋