三葉崖爬藤種質資源評價及質量控制技術研究.pdf

1、三葉崖爬藤（Tetrastigma hemsleyanum Diels et Gilg）是中國特有的葡萄科崖爬藤屬植物，分布于中國南部地區(qū)。其塊根入藥，具有抗炎、陣痛、解熱的功效。主治高熱驚厥、肺炎、咳喘、肝炎、腎炎、風濕痹痛、跌打損傷、毒蛇咬傷等癥。其中主要的活性化學成分為多酚類。作為民間常用的抗腫瘤草藥，近年來對該植物從藥理活性到化學成分的研究都很熱門。由于該植物地域分布廣，已有研究表明不同產地的樣品在顯微結構及藥理活性上都有差異，

2、那么不同產地的三葉崖爬藤在化學成分上是否有差異，這種差異是由遺傳還是由環(huán)境因子引起，這方面的研究未見報道。因此，本文針對三葉崖爬藤藥材的質量控制，采用11個野生群體的樣品從遺傳(采用cpDNA和nSSR)、環(huán)境（氣候因子和土壤因子）及藥理作用（體外抗腫瘤活性）等方面開展相關研究，分析各因素對藥材化學多樣性的影響，探討三葉崖爬藤品質的成因，為三葉崖爬藤引種馴化和品種選育提出科學的建議，為三葉崖爬藤藥材持續(xù)發(fā)展奠定研究基礎。主要研究結果如下

3、:
　　(1)利用波譜學方法和質譜技術從三葉崖爬藤中鑒定出4種化合物，分別是白皮杉醇、白藜蘆醇、異槲皮苷、煙花苷。通過對照品比對及加樣回收率確定樣品中含有虎杖苷。這是首次從該植物中分離到白皮杉醇。
　　(2)利用高效液相分析技術結合多變量數據處理方法構建三葉崖爬藤的化學指紋圖譜與五種主要指標性成分定量分析相結合的化學多樣性評價體系，在此基礎上，將全國13個野生產地的三葉崖爬藤劃分為3種化學型。
　　(3)基于epDNA

4、和核微衛(wèi)星(SSR)兩套分析標記顯示:三葉崖爬藤物種具有較高的遺傳多樣性水平(cp DNA，h=0.227; SSR，He=0.428);種群間遺傳分化顯著(cp DNA, Fst=0.749, P＜0.001; SSR, Rst=0.369, P＜0.001);
　　兩套分子標記都將三葉崖爬藤分成2個譜系(cpDNA:廣西一支，其余一支;SSR:浙江一支，其余一支)，這兩個譜系的種群在化學成分上的分化同遺傳上的分化不一致。遺傳距

5、離與化學距離的Mantel test檢驗說明化學距離同基于葉綠體、SSR標記計算的群體間遺傳距離均不相關(FsT，r=0.091，P=0.310; RsT，r=0.122，P=0.204)，進一步證實三葉崖爬藤化學成分的變異受本文所選的遺傳標記的影響較小。
　　三葉崖爬藤不同種群五種化學成分的含量差異顯著(P＜0.007)，芪類化合物(stilbene)高的種群主要是浙江寧波、湖北利川和重慶金佛山;黃酮類化合物(flavonoid

6、)高的種群是廣西南丹和湖南吉首。
　　(4)通過廣義線性混合模型分析了13個氣候及6個土壤因子對三葉崖爬藤五種指標性成分的影響，闡明了氣候因子和土壤因子對三葉崖爬藤化學成分的貢獻率。結果發(fā)現氣候因子對三葉崖爬藤化學成分的貢獻率為35％，土壤因子為28％。影響化學成分積累的主要氣候因子是相對濕度、年降水量和年日照時數;土壤因子主要是pH值、速效鉀、速效磷和土壤有機質含量。
　　(5)采用響應曲面法以總酚含量和鐵還原抗氧化能力(

7、FRAP)為檢測指標進行提取方案的優(yōu)化。得到三葉崖爬藤中總酚最優(yōu)提取方案為乙醇濃度:70％，提取溫度:50℃，提取時間47 min。按照最優(yōu)方案實際得到的總酚含量為5.51 mg沒食子酸/每克干藥材，FRAP相當于92.10μmol硫酸亞鐵/每克干藥材，與模型預期值相符。
　　(6)不同干燥處理顯著影響藥材的總酚含量、抗氧化水平以及藥材的抗腫瘤活性。相關性分析揭示不同干燥處理的藥材總酚含量與FRAP、羥基氧自由基和DPPH的清除活

8、性呈正相關。不同干燥處理的藥材醇提物的乙酸乙酯部位體外抗腫瘤活性顯示:對K562腫瘤細胞株，30℃干燥處理、冷凍干燥和室溫陰干都具有較強的抗腫瘤活性。而對A549腫瘤細胞株，30℃干燥處理和室溫陰干具有較好的抗腫瘤活性。HPLC分析結果顯示:30℃干燥處理的藥材中白皮杉醇和白藜蘆醇的含量顯著上升。綜合總酚含量、抗氧化、體外抗腫瘤活性以及藥材中五種指標性成分的定量分析結果，作者推薦采用30℃干燥處理的加工方法。
　　結論:三葉崖爬藤