有機(jī)磷阻燃劑TCEP誘導(dǎo)N2a細(xì)胞的線粒體過氧化損傷.pdf

1、三-（β-氯乙基）磷酸酯(Tris(2-chloroethyl)phosphate，TCEP）作為優(yōu)良的阻燃增塑劑，廣泛用于建筑材料、家具、兒童玩具、電子產(chǎn)品和食品包裝袋等產(chǎn)品的制造過程中。TCEP作為添加劑與材料主要以非化學(xué)鍵方式結(jié)合，因此，會(huì)隨著產(chǎn)品的不斷磨損或長(zhǎng)時(shí)間的使用而揮發(fā)到環(huán)境中，且在自然條件下極難降解。TCEP可通過空氣吸入、飲食攝入和皮膚接觸等多種途徑進(jìn)入體內(nèi)。已有大量研究發(fā)現(xiàn)，TCEP具有生殖毒性和發(fā)育毒性，能夠影響心

2、臟、肝臟、腎臟和睪丸等器官的發(fā)育。近些年也有少量關(guān)于TCEP神經(jīng)毒性的報(bào)道，但有關(guān)TCEP對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的毒性作用機(jī)制尚不清楚。大腦是機(jī)體中代謝活性最旺盛的器官，需要大量的ATP供能，線粒體通過呼吸作用氧化葡萄糖產(chǎn)生ATP，以滿足腦細(xì)胞的功能活動(dòng)需求，因此線粒體的功能活動(dòng)正常，對(duì)腦結(jié)構(gòu)和功能正常具有重要的意義。而線粒體在合成ATP過程中會(huì)釋放活性氧自由基(Reactive oxide species，ROS)，過量的ROS可導(dǎo)致細(xì)胞過氧化損

3、傷。已有報(bào)道TCEP可誘導(dǎo)細(xì)胞的氧化應(yīng)激相關(guān)蛋白表達(dá)異常。細(xì)胞中ROS主要產(chǎn)生于線粒體，但目前為止，尚無TCEP對(duì)神經(jīng)細(xì)胞線粒體功能影響的報(bào)道。因此，本研究以小鼠腦神經(jīng)瘤細(xì)胞系(N2a)為實(shí)驗(yàn)材料，探討TCEP是否可以誘導(dǎo)線粒體的過氧化損傷及可能的機(jī)制，以及TCEP對(duì)自噬調(diào)節(jié)蛋白HDAC6表達(dá)和活性的影響，以期為TCEP的神經(jīng)毒性作用研究提供新的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。
　　本試驗(yàn)用不同濃度的TCEP(25、50、75、100μM)分別處理N2

4、a細(xì)胞24hr后，通過CCK-8法檢測(cè)TCEP對(duì)細(xì)胞活性的影響;并利用DCFH-DA法、TBARS比色法和羥胺法分別檢測(cè)細(xì)胞中ROS水平、丙二醛(Malondialdehyde，MDA)含量和超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)活性的變化，以判斷TCEP是否對(duì)細(xì)胞造成過氧化損傷。用25或50μM抗氧化劑維生素E(Vitamin E，VitE)預(yù)處理細(xì)胞1hr后，再用50μMTCEP處理24hr，使用DCFH

5、-DA法檢測(cè)線粒體中ROS水平，利用JC-1技術(shù)檢測(cè)線粒體膜電位的改變，又通過比色法檢測(cè)線粒體功能的相關(guān)指標(biāo)Ca2+-ATPase、細(xì)胞色素c(Cyt c)氧化酶活性的變化，來判斷線粒體的過氧化損傷的可能機(jī)制;使用免疫印跡技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Caspase-9、Caspase-3含量的改變，以探討線粒體依賴的細(xì)胞凋亡過程的變化;利用免疫印跡技術(shù)檢測(cè)自噬相關(guān)蛋白HDAC6和Ac-tubulin含量的改變，此外，又通過比色分

6、析HDAC6活性的變化，采用免疫熒光標(biāo)記和激光共聚焦技術(shù)觀察細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)的變化，來探究TCEP對(duì)自噬途徑的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn):(1)隨著TCEP濃度增加，細(xì)胞活性逐漸下降。(2)與對(duì)照組相比，細(xì)胞中ROS水平、MDA含量以及SOD活性呈TCEP濃度依賴性上升，但SOD與MDA的相對(duì)比值則表現(xiàn)出TCEP濃度依賴性下降的趨勢(shì)。(3)與對(duì)照組相比，隨著TCEP濃度的增加，線粒體內(nèi)ROS水平逐漸上升。(4)與對(duì)照組相比，加50μMTCEP處理后，熒

7、光顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，發(fā)出紅色熒光信號(hào)的細(xì)胞數(shù)量明顯減少，提示線粒體膜電位下降;此外，線粒體膜上Ca+-ATPase活性和Cytc氧化酶活性與對(duì)照組相比均顯著性下降(P＜0.01，P＜0.05)。(5)與對(duì)照組相比，50μM TCEP處理組，抗凋亡因子Bcl-2蛋白含量顯著減少(P＜0.01)，Caspase-9的活性片段增加，且活化的Caspase-3蛋白含量顯著性增多(P＜0.01)。(6)與對(duì)照組相比，50μM TCEP處理后，HD

8、AC6的表達(dá)量沒有明顯改變。但是，HDAC6的活性顯著下調(diào)(P＜0.01)，且HDAC6的去乙?；孜飔ubulin的乙?；揎楋@著增加(P＜0.01)。(7)利用激光共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組細(xì)胞中微管成厚束狀分布，而50μM TCEP處理后，胞內(nèi)的微管密度減少且細(xì)胞微管網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)瓦解。(8)VitE預(yù)處理能夠阻止50μM TCEP所引起的線粒體過氧化損傷，凋亡相關(guān)蛋白的變化，HDAC6活性的下調(diào)，tubulin乙酰化修飾上調(diào)以及微管