左旋聚乳酸定向納米纖維影響PC12細(xì)胞分化的蛋白質(zhì)組學(xué)研究.pdf

1、神經(jīng)系統(tǒng)是人體內(nèi)起主導(dǎo)作用的功能調(diào)節(jié)系統(tǒng)，但神經(jīng)系統(tǒng)再生能力有限。隨著神經(jīng)組織工程技術(shù)的發(fā)展，利用神經(jīng)組織工程技術(shù)制作的各種支架，為神經(jīng)損傷修復(fù)創(chuàng)造了有利條件。納米纖維具有較大的孔隙率，可以模擬胞外基質(zhì)形貌，尤其是定向納米纖維能引導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞的神經(jīng)突觸伸展，促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞分化，使得定向納米纖維成為神經(jīng)組織工程的一種良好的支架材料。蛋白質(zhì)是生物體行使其功能的基本單位，細(xì)胞內(nèi)的基因通過轉(zhuǎn)錄、翻譯、修飾產(chǎn)生蛋白質(zhì)后，才能最終行使相關(guān)功能。因此蛋白

2、質(zhì)組學(xué)的研究能更好地幫助人們了解機(jī)體內(nèi)各項(xiàng)生理功能的產(chǎn)生機(jī)制。對于定向納米纖維影響神經(jīng)細(xì)胞分化的分子機(jī)理研究，目前主要是采用傳統(tǒng)的分子生物學(xué)技術(shù)來研究，發(fā)現(xiàn)了單個(gè)或少量發(fā)揮重要作用的蛋白質(zhì)，然而在蛋白質(zhì)組學(xué)水平系統(tǒng)性分析定向納米纖維對神經(jīng)細(xì)胞的蛋白質(zhì)譜影響的研究至今仍未見報(bào)道。
　　本論文的目的是綜合運(yùn)用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)和生物信息學(xué)方法，研究左旋聚乳酸(PLLA)不定向/定向納米纖維對PC12細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)表達(dá)的影響，最終在蛋白質(zhì)層次

3、揭示PLLA定向納米纖維對PC12細(xì)胞的影響。隨后與本課題組前期的研究結(jié)果(mRNA表達(dá)譜和microRNA表達(dá)譜)進(jìn)行聯(lián)合分析，從mRNA-microRNA-蛋白質(zhì)角度闡釋PLLA定向納米纖維影響PC12細(xì)胞分化的分子機(jī)理。最后，將本論文的聯(lián)合分析結(jié)果與本課題組其他研究的聯(lián)合分析結(jié)果進(jìn)行類比分析，探究microRNA在生物材料影響細(xì)胞行為過程中的作用機(jī)制。此外，本論文還采用人工合成的GRGDS五肽對整聯(lián)蛋白在PLLA定向納米纖維影響P

4、C12細(xì)胞分化的介導(dǎo)作用進(jìn)行干擾，研究整聯(lián)蛋白的介導(dǎo)機(jī)理。
　　本論文的具體工作如下:
　　1、采用靜電紡絲法制備左旋聚乳酸(PLLA)不定向/定向納米纖維，采用勻膠法制備PLLA薄膜。對三種材料進(jìn)行了紅外光譜分析、掃描電子顯微鏡(SEM)觀察、接觸角測定和力學(xué)性能測試的表征。結(jié)果表明，三種實(shí)驗(yàn)材料化學(xué)組成性質(zhì)一致，均為PLLA;PLLA薄膜表面比較平滑，不定向/定向納米纖維粗細(xì)均一且無串珠，直徑分別為238.20±4.88

5、nm和269.30±4.27nm，定向納米纖維具有較好的取向性;經(jīng)過處理后，三種材料的親水性均逐步提升，有利于細(xì)胞的粘附;PLLA定向納米纖維的彈性模量(1214.48±58.47MPa)遠(yuǎn)高于PLLA不定向納米纖維的彈性模量(99.15±41.44MPa)，提高取向性后PLLA納米纖維的韌性增強(qiáng)。
　　2、將預(yù)分化48h的PC12細(xì)胞分別種植在PLLA薄膜（Control組）、PLLA不定向納米纖維（RF組）和PLLA定向納米纖

6、維(AF組)上，隨后對細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞活力測定和細(xì)胞形貌（吖啶橙染色和掃描電鏡）觀察，并采用高內(nèi)涵分析系統(tǒng)(HCS)測定三組材料表面的PC12細(xì)胞的突觸長度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，和陰性對照組的細(xì)胞相比，三組材料表面的細(xì)胞活力在90％以上，表明細(xì)胞活力狀況良好;PC12細(xì)胞在薄膜表面基本呈圓形，在兩種納米纖維表面則伸出突觸，但在不定向納米纖維表面其突觸較短且向不同方向伸展，在定向納米纖維表面的PC12細(xì)胞的突觸長度沿纖維取向向外伸展，且長度明顯大于

7、Control組和RF組;HCS測定結(jié)果表明PLLA定向納米纖維表面生長的單個(gè)細(xì)胞所含突觸總長度平均值顯著大于PLLA不定向納米纖維組和PLLA薄膜組。以上結(jié)果說明PLLA定向納米纖維更有利于PC12細(xì)胞的分化。
　　3、采用基于iTRAQ標(biāo)記的定量蛋白質(zhì)組學(xué)鑒定技術(shù)分別鑒定了預(yù)分化48h的PC12細(xì)胞接種于三種實(shí)驗(yàn)材料表面24h后細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)表達(dá)信息，計(jì)算了每種蛋白質(zhì)的相對豐度，并進(jìn)一步分析了生長在PLLA不定向/定向納米纖維

8、表面的PC12細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)表達(dá)情況的差異。結(jié)果表明，相對于Control組，RF組和AF組分別有235和281種蛋白質(zhì)發(fā)生差異表達(dá)。
　　4、采用生物信息學(xué)方法對差異表達(dá)蛋白質(zhì)進(jìn)行了聚類分析、GO功能分析和生物學(xué)通路分析。結(jié)果顯示，RF組中3個(gè)上調(diào)表達(dá)蛋白質(zhì)涉及1個(gè)分化相關(guān)GO功能，4個(gè)下調(diào)表達(dá)蛋白質(zhì)涉及2個(gè)分化相關(guān)GO功能;AF組14個(gè)上調(diào)表達(dá)蛋白質(zhì)涉及3個(gè)分化相關(guān)GO功能。RF組和AF組差異表達(dá)蛋白質(zhì)分別涉及8個(gè)和11個(gè)分化相

9、關(guān)生物學(xué)通路。相對于RF組，AF組的分化相關(guān)差異表達(dá)蛋白質(zhì)數(shù)量更多，且涉及的分化相關(guān)生物學(xué)通路更多。本論文通過Western Blot和乙酰膽堿檢測實(shí)驗(yàn)對蛋白質(zhì)組學(xué)鑒定和生物信息學(xué)分析結(jié)果進(jìn)行了驗(yàn)證。
　　5、對所得的蛋白質(zhì)組學(xué)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和小組前期得到的mRNA和microRNA表達(dá)譜芯片實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行聯(lián)合分析。結(jié)果表明，PLLA不定向納米纖維組發(fā)生差異表達(dá)的mRNA、miRNA和蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)無匹配部分，而PLLA定向納米纖維可能通

10、過miR-24、miR-25、miR-92a、miR-19b、miR-183、miR-29a、miR-29c、miR-23b調(diào)控Dnajb12、Rhob、Wbp11、Hmgcs1、Hmgn2基因的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)控粘著斑信號通路和細(xì)胞骨架、基因表達(dá)、轉(zhuǎn)運(yùn)、加工合成、代謝、發(fā)育、應(yīng)激等GO功能。最后，將本論文的聯(lián)合分析結(jié)果與本課題組其他研究的聯(lián)合分析結(jié)果進(jìn)行類比分析，結(jié)果表明細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的表達(dá)是由多個(gè)microRNA綜合作用的結(jié)果，而且在此過

11、程中有其他調(diào)控機(jī)制也發(fā)揮作用。
　　6、通過基于iTRAQ標(biāo)記的定量蛋白質(zhì)組學(xué)鑒定技術(shù)，發(fā)現(xiàn)種植在PLLA定向納米纖維上的PC12細(xì)胞的整聯(lián)蛋白受到GRGDS五肽干擾后，有250個(gè)蛋白質(zhì)發(fā)生了差異表達(dá)，并且大部分與細(xì)胞分化相關(guān)的生物學(xué)通路發(fā)生了改變，表明整聯(lián)蛋白對于PLLA定向納米纖維誘導(dǎo)PC12細(xì)胞分化的過程中發(fā)揮了重要作用。再結(jié)合課題組前期mRNA表達(dá)譜和micorRNA表達(dá)譜技術(shù)聯(lián)合分析了胞內(nèi)mRNA、miRNA和蛋白質(zhì)的表