戊二醛、肝素交聯(lián)修飾改性腎臟脫細(xì)胞支架的試驗(yàn)研究.pdf

1、目的：
　　通過(guò)灌注法制備戊二醛、肝素交聯(lián)改性去細(xì)胞全腎支架，以提升去細(xì)胞腎支架的降解時(shí)間、生物力學(xué)性能及抗凝等指標(biāo)，以更接近臨床需要。
　　方法：
　　1.實(shí)驗(yàn)分組
　　SD大鼠160只，隨機(jī)分為4組，每組40只，第一組（D組）：去細(xì)胞腎支架；第二組（G組）：去細(xì)胞腎臟支架交聯(lián)戊二醛；第三組（H組）：去細(xì)胞腎臟支架交聯(lián)肝素；第四組（G+H組）：去細(xì)胞腎臟支架交聯(lián)戊二醛后再交聯(lián)肝素。
　　2.制備各組去細(xì)胞

2、腎臟支架
　　SD大鼠腹主動(dòng)脈行留置針置管，經(jīng)下方腹主動(dòng)脈置入2號(hào)留置針并固定，剪破上、下腔靜脈促使血液盡快流出，連接蠕動(dòng)泵，各組腎臟相應(yīng)被依次灌入0.01％肝素溶液、1%TritonX-100、0.8%十二烷基硫酸鈉（SDS）、去離子水，0.625%戊二醛（GA）、0.002%肝素鈉溶液及含有雙抗（青霉素-鏈霉素）的去離子水，各組獲得去細(xì)胞腎臟均浸泡于生理鹽水4℃冰箱存儲(chǔ)備用。
　　3.病理學(xué)觀察
　?。?）大體觀察

3、腎臟外形及顏色差異變化；
　?。?）HE染色、masson染色及掃描電鏡觀察各組去細(xì)胞腎臟組織膠原形態(tài)微結(jié)構(gòu)；
　　4.生物力學(xué)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性觀察
　　（1）通過(guò)體外降解率、吸水率對(duì)支架內(nèi)部結(jié)構(gòu)進(jìn)行穩(wěn)定性評(píng)估
　?。?）通過(guò)生物力學(xué)檢測(cè)，包括：極限抗張強(qiáng)度（Mpa）、斷裂伸長(zhǎng)率（%）及彈性模量
　　5.抗凝性觀察
　?。?）甲苯胺藍(lán)染色觀察去細(xì)胞腎支架是否成功交聯(lián)肝素；
　?。?）血小板黏附試驗(yàn)將各

4、組去細(xì)胞腎支架切取成0.5cmx0.3cm大小組織塊，放
　　入富血小板血漿內(nèi)震蕩6h，取出后依次通過(guò)去離子水浸泡、0.5%戊二醛固定、梯度脫水、干燥、鍍金，最后在電子掃描電鏡觀察樣本采集圖像。
　　6.組織相容性檢測(cè)
　　大鼠背部正中線(xiàn)兩側(cè)取1cm大小切口切開(kāi)分離至皮下深筋膜層構(gòu)建四個(gè)囊袋，分別植入四組標(biāo)本（1/4單腎），于3D，1W，2W，4W，8W取出皮下植入支架組織，行HE染色觀察支架內(nèi)部炎癥反應(yīng)及血管生成情況

5、；
　　7.細(xì)胞相容性
　?。?）CCk-8細(xì)胞增殖-毒性檢測(cè)
　　第一步：制作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)所制備細(xì)胞懸液中的細(xì)胞數(shù)量，將該細(xì)胞懸液等比稀釋成3-5個(gè)細(xì)胞濃度梯度（每組做4個(gè)復(fù)孔）接種于96孔板，37℃5%CO2培養(yǎng)箱孵育2h見(jiàn)細(xì)胞貼壁，加入cck-8（10ul）培養(yǎng)2h，酶標(biāo)儀測(cè)定450nm吸光度（OD值），制作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，其中，X軸：細(xì)胞數(shù)量；Y軸：OD值。
　　第二步：樣本的測(cè)定及檢測(cè)各組腎支架行冰

6、凍切片（厚10um）貼附于六孔板爬片備用，血管內(nèi)皮細(xì)胞計(jì)數(shù)后（平均7-10×104/ml）制成細(xì)胞懸液，分別接種于備用爬片及空白爬片并置入37℃5%CO2培養(yǎng)箱孵育7D，5D，3D，2D，1D，每孔加入200ul cck-8溶液，置入培養(yǎng)箱孵育2h，移液槍移入96孔板，酶標(biāo)儀測(cè)定450nm吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算細(xì)胞存活率、抑制率。
　?。?）免疫熒光染色各組腎支架行冰凍切片（厚10um）貼附于六孔板爬片備用，血管內(nèi)皮細(xì)胞計(jì)數(shù)后（

7、平均7-10×104/ml）滴于爬片共培養(yǎng)，三天后取出行免疫熒光染色觀察，PBS清洗殘余培養(yǎng)基，甲醛固定后，血清封閉，滴加一抗（Collagen IV抗體抗鼠、sma抗體抗兔）置入暗盒于4℃冰箱孵化過(guò)夜，次日滴加二抗（755綠光抗鼠，694紅光抗兔）及DAPI復(fù)染后熒光顯微鏡下觀察。
　　結(jié)果：
　　1.大體觀察各組去細(xì)胞腎支架保存腎臟原有外形，D組呈半透明白色，稍塌陷，其余三組去細(xì)胞腎支架形態(tài)較未交聯(lián)前更立體，交聯(lián)戊二醛后

8、的去細(xì)胞腎支架顏色呈淡黃色。
　　2.病理學(xué)觀察
　　HE染色及Masson染色觀察可見(jiàn)各組細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrixc,ECM）成分完整，膠原無(wú)斷裂，清晰可見(jiàn)明顯類(lèi)似腎小球、腎小管、血管結(jié)構(gòu)輪廓，纖維及基膜等機(jī)構(gòu)連續(xù)完整，腎小球及腎小管內(nèi)均未見(jiàn)細(xì)胞殘留結(jié)構(gòu)；掃描電鏡清晰可見(jiàn)未交聯(lián)組和交聯(lián)組去細(xì)胞腎支架上未見(jiàn)細(xì)胞殘留，膠原連續(xù)連接，無(wú)斷裂，交聯(lián)組可見(jiàn)支架上附著各對(duì)應(yīng)的藥物顆粒。
　　3.生物力

9、學(xué)及組織穩(wěn)定性觀察
　　G+H組及G組腎支架降解率遠(yuǎn)低于D組腎支架（P＜0.05）；D組吸水率（94.88%）高于G組（88.14%）及G+H組（88.72%）（P＜0.05）；戊二醛交聯(lián)后提高了腎支架的力學(xué)性能，包括：極限抗張強(qiáng)度和彈性模量（P＜0.05）。
　　4.抗凝性觀察肝素交聯(lián)（H組和G+H組）去細(xì)胞腎支架上未見(jiàn)明顯血小板黏附，而未進(jìn)行肝素交聯(lián)（D組，G組）腎支架布滿(mǎn)血小板。
　　5.組織相容性觀察
　

10、　背部皮下包埋結(jié)果顯示未進(jìn)行交聯(lián)的腎支架在包埋兩周便開(kāi)始降解，通過(guò)GA交聯(lián)后腎支架包埋4周才出現(xiàn)降解現(xiàn)象，各組包埋腎支架內(nèi)部均可見(jiàn)新生血管。
　　6.細(xì)胞相容性觀察
　　CCK-8試驗(yàn)提示各組的去細(xì)胞腎支架和血管內(nèi)皮細(xì)胞共培養(yǎng)后，均未產(chǎn)生細(xì)胞毒性，同時(shí)與空白組相比較，表現(xiàn)出一定的促細(xì)胞增殖作用。各實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組去細(xì)胞腎支架分別與腎的血管內(nèi)皮細(xì)胞共培養(yǎng)三天后行免疫熒光染色顯示，細(xì)胞均能良好的貼附于支架生長(zhǎng)，表現(xiàn)出良好的細(xì)胞相容