MiR-1275通過上調(diào)IGF-1R及CCR7的表達(dá)從而促進(jìn)頭頸鱗癌的增殖、遷移及侵襲能力.pdf

1、目的：頭頸鱗癌是頭頸部常見的起源于皮膚及黏膜上皮襯里的高侵襲性惡性腫瘤。由于頭頸鱗癌在腫瘤生物學(xué)行為上具有的強(qiáng)局部侵襲能力及易向周圍及遠(yuǎn)處淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的特點(diǎn)，導(dǎo)致了頭頸鱗癌患者預(yù)后較差，使其總體五年生存率持續(xù)較低。近些年來，隨著有關(guān)于頭頸鱗癌中異常表達(dá)的miRNA與頭頸鱗癌發(fā)生發(fā)展關(guān)系的研究報道大量出現(xiàn)，為我們深入了解頭頸鱗癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制提供了巨大幫助。但是對于一些miRNA在頭頸鱗癌中發(fā)揮的具體作用及作用方式，我們的了解仍然具有一

2、定的局限性。miRNA是非編碼蛋白質(zhì)的單鏈小RNA分子，它可以與目標(biāo)mRNA的3'端非編碼區(qū)域結(jié)合發(fā)揮作用，通過降解目標(biāo)mRNA或抑制mRNA的翻譯從而調(diào)控基因的表達(dá)量。已證明miRNA可以參與許多疾病的發(fā)展過程，特別是惡性腫瘤。然而，目前雖然已有許多研究證實(shí)了在多種疾病中miR-1275的表達(dá)量異常，但是有關(guān)于miR-1275在頭頸鱗癌發(fā)生發(fā)展過程中起何種作用的信息仍十分有限，因此miR-1275在惡性腫瘤特別是頭頸鱗癌中發(fā)揮的具體作

3、用及作用方式還需要我們進(jìn)一步的研究。IGF-1R在已發(fā)表的研究中被證明在頭頸鱗癌中高表達(dá)，且通過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了其在頭頸鱗癌細(xì)胞中可以通過激活PI3K/AKT信號通路從而提高頭頸鱗癌的轉(zhuǎn)移能力。課題組在之前的研究中發(fā)現(xiàn)了CCR7在頭頸鱗癌中的高表達(dá)趨勢，證明CCR7同樣可以激活PI3K/AKT信號通路從而參與調(diào)控頭頸鱗癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移過程。PI3K/AKT信號通路在頭頸鱗癌的發(fā)生發(fā)展過程中所起到的重要作用已經(jīng)被研究者廣泛認(rèn)同。
　　方法：

4、⑴使用實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)(Real Time PCR)檢測頭頸鱗癌病灶組織及頭頸鱗癌細(xì)胞中miR-1275的表達(dá)量。⑵利用從TCGA數(shù)據(jù)庫中獲取的頭頸鱗癌患者的臨床數(shù)據(jù)以及他們的miR-1275表達(dá)譜數(shù)據(jù)，對表達(dá)有miR-1275的頭頸鱗癌患者進(jìn)行生存分析。⑶使用能夠過表達(dá)miR-1275的mimics質(zhì)粒及能夠抑制miR-1275表達(dá)的inhibitor片段，通過瞬時轉(zhuǎn)染技術(shù)將它們導(dǎo)入頭頸鱗癌細(xì)胞，達(dá)到調(diào)控頭頸鱗癌細(xì)胞中miR-1

5、275表達(dá)量的目的。通過細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)（劃痕實(shí)驗(yàn)、Transwell實(shí)驗(yàn)和CCK8實(shí)驗(yàn)）驗(yàn)證miR-1275在頭頸鱗癌細(xì)胞中所起的作用。各項實(shí)驗(yàn)按照研究目的均分為五組，即空白對照組、miR-1275過表達(dá)組、過表達(dá)陰性對照組、miR-1275抑制表達(dá)組及抑制表達(dá)陰性對照組。⑷利用Western blot實(shí)驗(yàn)檢測轉(zhuǎn)染mimics質(zhì)粒及inhibitor片段后的頭頸鱗癌細(xì)胞中預(yù)測靶基因的蛋白表達(dá)量的變化情況。
　　結(jié)果：①在15對頭頸鱗

6、癌臨床標(biāo)本的實(shí)時熒光定量PCR檢測數(shù)據(jù)結(jié)果中（取自15名患者，其中15例頭頸鱗癌病灶組織，15例對應(yīng)的癌旁正常組織），我們發(fā)現(xiàn)了相較于癌旁正常組織，頭頸鱗癌病灶組織中的miR-1275表達(dá)量有所上調(diào)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。依據(jù)頭頸鱗癌細(xì)胞的實(shí)時熒光定量PCR數(shù)據(jù)結(jié)果顯示，miR-1275在PCI-37A/37B及PCI-4A/4B四種頭頸鱗癌細(xì)胞中均可被檢測出（A:取自于頭頸鱗癌患者的原發(fā)病灶，B:取自于同一患者的轉(zhuǎn)移淋巴

7、結(jié)組織）。其中PCI-37B中miR-1275的表達(dá)量顯著高于PCI-37A，而PCI-4B中的miR-1275表達(dá)量也同樣高于PCI-4A，以上差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。我們依據(jù)這些數(shù)據(jù)結(jié)果推斷miR-1275在頭頸鱗癌的發(fā)生發(fā)展過程中可能起到了重要作用。②使用過表達(dá)miR-1275的mimics質(zhì)粒、抑制miR-1275表達(dá)的inhibitor片段以及它們各自對應(yīng)的陰性對照，分別轉(zhuǎn)染頭頸鱗癌細(xì)胞（PCI-37B）。利用實(shí)時

8、熒光定量PCR技術(shù)，證實(shí)了分別轉(zhuǎn)染過表達(dá)質(zhì)粒及抑制表達(dá)片段后的頭頸鱗癌細(xì)胞中miR-1275的表達(dá)量顯著上升和下調(diào)，轉(zhuǎn)染陰性對照的兩組頭頸鱗癌細(xì)胞中的miR-1275表達(dá)量無明顯改變。③通過CCK8實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證miR-1275對頭頸鱗癌細(xì)胞增殖能力的影響，依據(jù)CCK8實(shí)驗(yàn)的結(jié)果數(shù)據(jù)制成標(biāo)準(zhǔn)曲線。按照標(biāo)準(zhǔn)曲線趨勢得出結(jié)論，抑制頭頸鱗癌細(xì)胞中miR-1275的表達(dá)可以降低細(xì)胞的增殖能力，增加細(xì)胞中miR-1275的表達(dá)量可以促進(jìn)細(xì)胞的增殖能力。

9、證明miR-1275可以促進(jìn)頭頸鱗癌細(xì)胞的增殖能力。④通過劃痕實(shí)驗(yàn)及transwell遷移實(shí)驗(yàn)檢測轉(zhuǎn)染后的頭頸鱗癌細(xì)胞遷移能力的改變。抑制頭頸鱗癌細(xì)胞中miR-1275的表達(dá)量后，可以發(fā)現(xiàn)細(xì)胞的遷移能力顯著降低;而上調(diào)miR-1275的表達(dá)量后，細(xì)胞遷移能力則顯著提升。結(jié)果證明了miR-1275的表達(dá)量與頭頸鱗癌細(xì)胞的遷移能力呈正相關(guān)趨勢。⑤使用Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)探究miR-1275對頭頸鱗癌細(xì)胞侵襲能力的影響。可以發(fā)現(xiàn)抑制頭頸

10、鱗癌細(xì)胞中miR-1275的表達(dá)量后，細(xì)胞的侵襲能力顯著下降;而上調(diào)細(xì)胞中miR-1275表達(dá)量后，細(xì)胞的侵襲能力顯著上升。這說明miR-1275可以促進(jìn)頭頸鱗癌細(xì)胞的侵襲能力。⑥從TCGA數(shù)據(jù)庫中查詢到頭頸鱗癌患者的臨床數(shù)據(jù)以及其miR-1275的表達(dá)譜數(shù)據(jù)。利用ROC曲線獲得分組臨界值，根據(jù)該值將表達(dá)有miR-1275的頭頸鱗癌患者分為兩組。制作KM曲線并使用Log Rank檢驗(yàn)獲取顯著性P值。我們發(fā)現(xiàn)了這樣的趨勢，即miR-127

11、5表達(dá)量低的頭頸鱗癌患者生存時間長于miR-1275表達(dá)量高的患者。⑦為了明確miR-1275參與頭頸鱗癌轉(zhuǎn)移過程的作用機(jī)制，我們利用Westernblot實(shí)驗(yàn)檢測miR-1275能否通過調(diào)控IGF-1R及CCR7的蛋白表達(dá)量，參與調(diào)控頭頸鱗癌的發(fā)生發(fā)展過程。通過轉(zhuǎn)染技術(shù)抑制頭頸鱗癌細(xì)胞中miR-1275的表達(dá)量后，我們發(fā)現(xiàn)IGF-1R及CCR7的蛋白表達(dá)量顯著下降;而上調(diào)miR-1275的表達(dá)量后，IGF-1R及CCR7的蛋白表達(dá)量顯

12、著提高。據(jù)此我們可以合理推測，miR-1275可以通過增加IGF-1R及CCR7的蛋白表達(dá)量從而促進(jìn)頭頸鱗癌細(xì)胞的遷移、侵襲及增殖能力。
　　結(jié)論：⑴相較于癌旁正常組織及轉(zhuǎn)移能力低的頭頸鱗癌細(xì)胞，miR-1275在頭頸鱗癌病灶組織及轉(zhuǎn)移能力高的頭頸鱗癌細(xì)胞中表達(dá)量有所上調(diào)。⑵生存分析結(jié)果提示，miR-1275表達(dá)量低的頭頸鱗癌患者的生存時間可能更長。⑶miR-1275可以起到類似于癌基因的作用從而促進(jìn)頭頸鱗癌細(xì)胞的侵襲、遷移及增殖