文昌魚神經(jīng)胚差減文庫(kù)構(gòu)建和兩個(gè)胚胎發(fā)育相關(guān)基因的表達(dá)研究.pdf

1、文昌魚在進(jìn)化上占據(jù)重要的地位，它身體構(gòu)造簡(jiǎn)單，皮膚和胚胎透明，肉眼即可觀察到內(nèi)部的發(fā)育情況，而且它基本軀體構(gòu)成與脊椎動(dòng)物相同，因此一直以來(lái)都是脊椎動(dòng)物起源進(jìn)化和發(fā)育機(jī)制研究的理想的模式動(dòng)物。在文昌魚胚胎發(fā)育的過(guò)程中，神經(jīng)胚是一個(gè)非常關(guān)鍵的時(shí)期，涉及到許多重要器官的形成和組織分化，尤其是神經(jīng)管的形成和體節(jié)的出現(xiàn)。
　　 為了篩選在這一胚胎發(fā)育階段中起到重要調(diào)控作用的基因，我們應(yīng)用抑制性差減雜交技術(shù)構(gòu)建了白氏文昌魚(Branchio

2、stoma belcheri)神經(jīng)胚差減文庫(kù)，測(cè)序得到的204個(gè)EST序列去掉重復(fù)序列后進(jìn)行拼接，得到了82個(gè)單獨(dú)的拼接體。序列比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)82個(gè)拼接體中56％與其它物種中的已知基因同源，其余的44％與已知基因沒(méi)有明顯的相似性，將其暫定為未鑒定基因。用RTqPCR對(duì)這些基因在原腸胚和神經(jīng)胚中的差異表達(dá)進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果顯示70％在神經(jīng)胚階段呈現(xiàn)高表達(dá)。進(jìn)一步對(duì)未鑒定基因進(jìn)行詳細(xì)的序列分析，發(fā)現(xiàn)其中3個(gè)在佛羅里達(dá)文昌魚中存在同源基因，但在其它

3、物種中未發(fā)現(xiàn)有同源基因存在，因此認(rèn)為它們是文昌魚特有的基因。對(duì)這些特有基因進(jìn)行深入的研究將會(huì)為文昌魚神經(jīng)胚發(fā)育的研究工作提供更多有價(jià)值的資料。
　　 在神經(jīng)胚差減文庫(kù)中，我們篩選到了一個(gè)脊椎動(dòng)物FABP基因的同源基因-AmphiFABP，進(jìn)一步應(yīng)用RACE PCR擴(kuò)增了該基因的cDNA全序列，并對(duì)其在不同發(fā)育時(shí)期胚胎中的表達(dá)情況進(jìn)行了研究，以期弄清其與脊椎動(dòng)物FABP基因家族的關(guān)系。系統(tǒng)進(jìn)化分析表明，該基因是脊椎動(dòng)物中6個(gè)FAB

4、P家族成員(H-FABP、B-FABP、E-FABP、M-FABP、A-FABP和T-FABP)共同的祖先基因。RTqPCR和原位雜交分析結(jié)果表明，在文昌魚神經(jīng)胚早期，AmphiFABP基因的表達(dá)量遠(yuǎn)高于其它時(shí)期，其表達(dá)部位主要集中在背部的神經(jīng)外胚層和體節(jié)中，說(shuō)明AmphiFABP基因與文昌魚的神經(jīng)管形成和體節(jié)出現(xiàn)相關(guān)。
　　 此外，我們還擴(kuò)增了神經(jīng)胚差減庫(kù)中發(fā)現(xiàn)的文昌魚AmphiN57基因的全長(zhǎng)cDNA，佛羅里達(dá)文昌魚基因組的

5、搜索結(jié)果顯示，除AmphiN57外，文昌魚中還有另外兩個(gè)與AmphiN57高度相似的基因Bf N57L和Bf N57L2，以上三種基因的蛋白都含有2個(gè)EF-hand(EFh)結(jié)構(gòu)域，屬于EFh鈣結(jié)合蛋白超家族的成員。同源性分析發(fā)現(xiàn)，其它物種中不存在AmphiN57等三種基因的直系同源基因，只有NCS蛋白家族某些成員的EFh結(jié)構(gòu)域與AmphiN57等三種蛋白有較低的相似性(小于20％)，結(jié)合序列比對(duì)和系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的結(jié)果，推測(cè)以上三個(gè)基因由N

6、CS家族成員倍增后特化形成，它們共同組成NCS基因家族在文昌魚中特有的一個(gè)亞家族。時(shí)空表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)，AmphiN57基因特異的在原腸胚和神經(jīng)胚階段表達(dá)，神經(jīng)胚階段其表達(dá)量急劇增加，且在中胚層、內(nèi)胚層和神經(jīng)外胚層都有表達(dá)，由此推測(cè)該基因可能對(duì)胚胎發(fā)育過(guò)程中的神經(jīng)系統(tǒng)形成和胚層分化具有重要的調(diào)控作用。
　　 本研究還以日本文昌魚(Branchiostoma japonicum)性腺cDNA為材料構(gòu)建了文昌魚雌雄性腺的差減cDNA文庫(kù)

7、。正向差減雜交以卵巢為試驗(yàn)方、精巢為驅(qū)動(dòng)方，反向差減雜交以精巢為試驗(yàn)方、卵巢為驅(qū)動(dòng)方，最后獲得的正、反向差減文庫(kù)分別含459、243個(gè)重組子。PCR擴(kuò)增鑒定正、反向差減cDNA文庫(kù)的插入片段，其中90％左右的克隆皆能擴(kuò)增出有效產(chǎn)物，插入片段范圍為200-600 bp，符合差減文庫(kù)PCR產(chǎn)物片段的大小。隨機(jī)選取30個(gè)陽(yáng)性克隆測(cè)序分析，得到26個(gè)有效基因片段，進(jìn)一步從中選取16個(gè)序列，用RTqPCR對(duì)文庫(kù)質(zhì)量進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果表明所建文庫(kù)能夠達(dá)