鞘磷脂合成酶2缺乏對(duì)小鼠腦缺血再灌注損傷后炎癥反應(yīng)的影響及其機(jī)制研究.pdf

1、缺血性腦卒中發(fā)病率高、病死率高、致殘率高、復(fù)發(fā)率高,是危害我國人民健康的主要疾病之一。雖然現(xiàn)在已明確了超早期溶栓的有效性,但由于其嚴(yán)格的治療時(shí)間窗,其臨床應(yīng)用受到一定的限制。因此,腦缺血后如何減輕繼發(fā)性腦損傷是目前臨床面臨的重要課題。研究表明腦缺血后發(fā)生在缺血半暗帶的過度的炎癥反應(yīng)是造成繼發(fā)性腦損傷的主要原因:阻斷抗炎信號(hào)通路加重繼發(fā)性腦損傷,而抑制炎癥介質(zhì)的過度表達(dá)則減輕腦缺血后繼發(fā)性腦損傷。因此,尋找炎癥反應(yīng)的有效靶點(diǎn)進(jìn)行靶向干預(yù),

2、是減輕缺血再灌注損傷后的炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵。鞘磷脂由鞘氨醇、脂酸和磷酸膽堿構(gòu)成,是人體內(nèi)含量最多的鞘磷脂,也是構(gòu)成生物膜的重要組分,與卵磷脂并存于細(xì)胞膜外側(cè),廣泛存在于生物組織內(nèi),在腦組織中含量尤為豐富。鞘磷脂合成酶(sphingomyelin synthase,SMS)是鞘磷脂合成途徑中的最后一個(gè)酶,SMS有兩種同工酶:SMS1和SMS2。SMS1主要存在于高爾基體,而SMS2主要存在于質(zhì)膜上,在腦組織中廣泛表達(dá)。其中SMS2是炎癥反應(yīng)中

3、重要的調(diào)控因子。SMS2缺乏可抑制由脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞TLR4/NF-κB通路的活化,提示SMS2參與了對(duì)炎癥反應(yīng)的調(diào)控。但目前關(guān)于SMS2對(duì)腦缺血再灌注損傷后炎癥反應(yīng)的作用及機(jī)制尚不清楚,仍有待于進(jìn)一步研究。近期研究發(fā)現(xiàn),腦缺血后小膠質(zhì)細(xì)胞分泌大量的半乳糖凝集素-3(galectin-3),galectin-3是TLR4的內(nèi)源性配體,其通過誘導(dǎo)TLR4募集到脂筏區(qū)域并與之結(jié)合激活TLR

4、4通路,加重炎癥反應(yīng)。脂筏是細(xì)胞膜上由神經(jīng)鞘磷脂、膽固醇和鞘糖脂相互作用形成的細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)微結(jié)構(gòu)域,與膜的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、蛋白質(zhì)分選密切相關(guān)。
　　第一部分：鞘磷脂合成酶2缺乏減輕了小鼠腦缺血再灌注損傷
　　目的:通過對(duì)野生型(WT)小鼠和SMS2敲除(SMS2-/-)小鼠在腦缺血再灌注損傷后進(jìn)行神經(jīng)功能缺損評(píng)分、腦梗死體積測(cè)定,觀察SMS2缺乏對(duì)小鼠腦缺血再灌注損傷的作用。
　　方法:實(shí)驗(yàn)選用8-12周齡的健康雄性C56B

5、L/6小鼠及以C57BL/6為背景的SMS2敲除小鼠為研究對(duì)象。采用線栓法建立的小鼠短暫性大腦中動(dòng)脈閉塞模型。實(shí)驗(yàn)分為WT小鼠和SMS2-/-小鼠兩組,分別在手術(shù)造模后24小時(shí)和72小時(shí)進(jìn)行神經(jīng)功能缺損評(píng)分,2,3,5-氯化三苯基四氮唑(2,3,5-triphenyltetrazolium chloride,TTC)染色測(cè)定腦梗死體積。
　　結(jié)果：
　　1.蔗糖密度梯度離心結(jié)果顯示：與正常組相比，在腦缺血再灌注后24小時(shí)和7

6、2小時(shí)，TLR4在脂筏區(qū)域大量表達(dá)；與WT小鼠相比，SMS2-/-小鼠TLR4在脂筏區(qū)域的表達(dá)明顯減少。
　　2.LC-MS/MS測(cè)定SM含量的結(jié)果顯示：與WT小鼠相比，SMS2-/-小鼠C14-SM，C16-SM，C18:1-SM，C18-SM，C20:1-SM和C24:1-SM在脂筏區(qū)域的含量明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05)。
　　結(jié)論：
　　1.本實(shí)驗(yàn)通過應(yīng)用線栓法成功建立了小鼠短暫性右側(cè)大腦中動(dòng)脈閉

7、塞模型，發(fā)現(xiàn)在腦缺血再灌注后72小時(shí)，與WT小鼠相比，SMS2-/-小鼠的神經(jīng)功能明顯得到改善，腦梗死體積顯著減少。
　　2.SMS2缺乏在腦缺血再灌注損傷后發(fā)揮的腦保護(hù)作用，有可能與其減少小膠質(zhì)細(xì)胞的激活、減少NF-κB的核轉(zhuǎn)位、減少促炎因子的表達(dá)有關(guān)。
　　3.SMS2缺乏通過減少脂筏組分SM的含量影響脂筏的功能，從而抑制TLR4受體由非脂筏區(qū)域向脂筏區(qū)域的募集，減少TLR4/MD2復(fù)合體的形成，進(jìn)而抑制下游TLR4/N

8、F-κB炎癥通路的激活。
　　第二部分：鞘磷脂合成酶2缺乏減輕了小鼠腦缺血再灌注損傷后的炎癥反應(yīng)
　　目的：
　　通過測(cè)定小鼠腦缺血再灌注損傷后缺血半暗帶炎癥因子的表達(dá)、小膠質(zhì)細(xì)胞的浸潤情況及TLR4、NF-κB的蛋白表達(dá)水平觀察鞘磷脂合成酶2缺乏對(duì)小鼠腦缺血再灌注損傷后炎癥反應(yīng)的影響。
　　方法：
　　實(shí)驗(yàn)選用8-12周齡的健康雄性C56BL/6（WT）小鼠及以C57BL/6為背景的SMS2敲除小鼠（SM

9、S2-/-）為研究對(duì)象。采用線栓法建立的小鼠短暫性大腦中動(dòng)脈閉塞模型。將WT小鼠和SMS2-/-小鼠隨機(jī)分為2組：假手術(shù)組（Sham）和大腦中動(dòng)脈閉塞組（tMCAO）。各組小鼠分別在手術(shù)造模后24小時(shí)和72小時(shí)，應(yīng)用RT-PCR檢測(cè)炎癥因子的表達(dá)，應(yīng)用免疫熒光染色的方法觀察小膠質(zhì)細(xì)胞的浸潤，應(yīng)用Western-blot檢測(cè)NF-κB的核轉(zhuǎn)位情況，應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)小膠質(zhì)細(xì)胞表面TLR4及TLR4/MD2復(fù)合體的表達(dá)情況。
　　結(jié)果

10、：
　　1.RT-PCR的結(jié)果顯示：在腦缺血再灌注損傷后24小時(shí)和72小時(shí)，與WT小鼠相比，SMS2-/-小鼠腦組織缺血半暗帶炎癥因子（IL-1β， galectin-3）mRNA水平的表達(dá)明顯降低，抑炎因子Arg-1的mRNA水平表達(dá)明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05)。
　　2.Western blot的結(jié)果顯示：與正常組相比，galectin-3蛋白水平的表達(dá)，在腦缺血再灌注后48小時(shí)和72小時(shí)明顯增高，差異具

11、有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05)；在腦缺血后72小時(shí)，與WT小鼠相比，SMS2-/-小鼠的galectin-3蛋白水平的表達(dá)明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05)。
　　3.免疫熒光的結(jié)果顯示：與非缺血側(cè)相比，缺血側(cè)Iba-1+的小膠質(zhì)細(xì)胞明顯增多，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05)；在腦缺血再灌注后72小時(shí)，與WT小鼠相比，SMS2-/-小鼠缺血側(cè)galectin-3+Iba-1+的小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量明顯減少，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（

12、P<0.05)；而Iba-1+的小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量與WT小鼠相比無明顯改變，不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05)。
　　4.Western blot的結(jié)果顯示：在腦缺血再灌注損傷后24小時(shí)和72小時(shí)，與WT小鼠相比，SMS2-/-小鼠腦組織缺血半暗帶NF-κB的核轉(zhuǎn)位明顯減少，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05)。
　　5.流式細(xì)胞儀分析結(jié)果顯示：在腦缺血再灌注后72小時(shí)，與WT小鼠相比，SMS2-/-小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞表面TLR4/MD

13、2復(fù)合體的表達(dá)減少；而TLR4的表達(dá)較WT小鼠無明顯改變。
　　第三部分：鞘磷脂合成酶2缺乏通過抑制TLR4向脂筏區(qū)域的募集發(fā)揮抗炎作用
　　目的：
　　通過測(cè)定小鼠腦缺血再灌注損傷后TLR4在脂筏組分和非脂筏組成的表達(dá)情況，以及鞘磷脂合成酶2缺乏后對(duì)脂筏成分及功能的影響，探討其在腦缺血再灌注損傷后發(fā)揮抗炎作用的可能作用機(jī)制。
　　方法：
　　采用8-12周齡的健康雄性 C57BL/6小鼠（WT）及以C57

14、BL/6小鼠為背景的SMS2敲除小鼠（SMS2-/-）作為研究對(duì)象，通過線栓法建立小鼠短暫性大腦中動(dòng)脈閉塞模型。將WT和SMS2-/-小鼠隨機(jī)分為2組：假手術(shù)組（Sham）和大腦中動(dòng)脈閉塞組（tMCAO）。各組小鼠于手術(shù)造模后24小時(shí)和72小時(shí)，應(yīng)用蔗糖梯度離心的方法檢測(cè)脂筏區(qū)域及非脂筏區(qū)域TLR4的表達(dá)情況，應(yīng)用液相串聯(lián)質(zhì)譜的發(fā)放（Liquid chromatography tandem mass spectrometry，LC-MS

15、/MS）測(cè)定各組分鞘磷脂（sphingomyelin，SM）的含量。
　　結(jié)果：
　　1.蔗糖密度梯度離心結(jié)果顯示：與正常組相比，在腦缺血再灌注后24小時(shí)和72小時(shí)，TLR4在脂筏區(qū)域大量表達(dá)；與WT小鼠相比，SMS2-/-小鼠TLR4在脂筏區(qū)域的表達(dá)明顯減少。
　　2.LC-MS/MS測(cè)定SM含量的結(jié)果顯示：與WT小鼠相比，SMS2-/-小鼠C14-SM，C16-SM，C18:1-SM，C18-SM，C20:1-SM

16、和C24:1-SM在脂筏區(qū)域的含量明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05)。
　　結(jié)論：
　　1.本實(shí)驗(yàn)通過應(yīng)用線栓法成功建立了小鼠短暫性右側(cè)大腦中動(dòng)脈閉塞模型，發(fā)現(xiàn)在腦缺血再灌注后72小時(shí)，與WT小鼠相比，SMS2-/-小鼠的神經(jīng)功能明顯得到改善，腦梗死體積顯著減少。
　　2.SMS2缺乏在腦缺血再灌注損傷后發(fā)揮的腦保護(hù)作用，有可能與其減少小膠質(zhì)細(xì)胞的激活、減少NF-κB的核轉(zhuǎn)位、減少促炎因子的表達(dá)有關(guān)。