hESCs來源視杯樣組織中C-kit+-SSEA-4-祖細(xì)胞的細(xì)胞生物學(xué)特性研究.pdf

1、視網(wǎng)膜變性類疾病常引起感光細(xì)胞、視網(wǎng)膜色素上皮(RPE)細(xì)胞等多種視網(wǎng)膜細(xì)胞變性、死亡。由于二者均不可再生，移植正常的視網(wǎng)膜組織或者細(xì)胞，被認(rèn)為是目前治療此類疾病最有前景的方法。許多研究者嘗試將干細(xì)胞分化為視網(wǎng)膜細(xì)胞后進(jìn)行移植，可避免成瘤性風(fēng)險(xiǎn)，但單一種類終末分化的細(xì)胞移植無法解決視網(wǎng)膜色素變性(RP)患者視網(wǎng)膜中多種細(xì)胞丟失的難題。
　　研究表明肺、腎等器官來源的c-kit+（干細(xì)胞因子受體）細(xì)胞可跨胚層分化，具有明顯的器官特異

2、性。Sasai等更是利用三維培養(yǎng)技術(shù)在體外成功誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞(ESCs)形成與體內(nèi)正常胚胎發(fā)育相似的視泡(OV)樣、視杯(OC)樣組織。推測(cè)hESC(hESC)來源的OV、OC樣組織中c-kit+細(xì)胞是具有向多種視網(wǎng)膜細(xì)胞分化能力的視杯特異性祖細(xì)胞，可能成為治療視網(wǎng)膜變性類疾病的新型種子細(xì)胞?？紤]到種子細(xì)胞的不可控增殖、成瘤等安全因素，我們同時(shí)篩除其中階段特異性胚胎抗原-4(SSEA-4)陽(yáng)性的未分化細(xì)胞。
　　本實(shí)驗(yàn)首先采用三維

3、培養(yǎng)技術(shù)誘導(dǎo)hESC形成OV、OC樣組織，并對(duì)其c-kit、SSEA-4的時(shí)空表達(dá)特點(diǎn)進(jìn)行研究，然后對(duì)OC樣組織中c-kit+/SSEA-4-細(xì)胞的細(xì)胞生物學(xué)特性進(jìn)行研究，從而為視網(wǎng)膜變性類疾病的治療提供理論依據(jù)。
　　目的:
　　1.觀察不同時(shí)間點(diǎn)三維培養(yǎng)OV、OC樣組織中c-kit、SSEA-4的空間表達(dá)特點(diǎn)及發(fā)育學(xué)變化規(guī)律;
　　2.通過流式細(xì)胞儀分選三維培養(yǎng)OV、OC樣組織中的c-kit+/SSEA-4-細(xì)胞，

4、并對(duì)其自我更新、增殖能力及多向分化潛能進(jìn)行鑒定。
　　方法:
　　1.采用三維培養(yǎng)技術(shù)誘導(dǎo)hESC H1細(xì)胞系形成OV、OC樣組織，并通過免疫熒光染色分析OV、OC樣組織中Pax6、Mitf Rax、Crx等相關(guān)標(biāo)記物的表達(dá)情況;
　　2.通過免疫熒光染色及流式細(xì)胞儀共同檢測(cè)hESC三維培養(yǎng)和誘導(dǎo)第7、14、21、30、49、70、90d OV、OC樣組織中c-kit、SSEA-4的時(shí)空表達(dá)規(guī)律;
　　3.流式細(xì)

5、胞儀分選三維培養(yǎng)第30天OC樣組織中的c-kit+/SSEA-4-細(xì)胞，通過免疫熒光鑒定第二代P2(Passage2)、P4、P6細(xì)胞Pax6、Nestin、Sox2等干細(xì)胞標(biāo)記物及增殖指標(biāo)Ki67的陽(yáng)性率，同時(shí)檢測(cè)其細(xì)胞周期;誘導(dǎo)P3c-kit+/SSEA-4-細(xì)胞的分化，通過免疫熒光鑒定c-kit+/SSEA-4-細(xì)胞分化為感光細(xì)胞、神經(jīng)節(jié)細(xì)胞及RPE細(xì)胞的潛能。
　　結(jié)果:
　　1.hESC三維培養(yǎng)第14天可見Rax+

6、 OV樣組織，第30天形成具有內(nèi)層Pax6+、外層Mitf+的雙層OC樣結(jié)構(gòu)，第90天可見部分Crx+細(xì)胞。
　　2.c-kit主要表達(dá)于hESC來源OV及OC的神經(jīng)上皮樣結(jié)構(gòu)中，SSEA-4早期均勻表達(dá)于整個(gè)組織，晚期則主要集中于周邊部。c-kit+細(xì)胞比例呈先升高后下降的趨勢(shì)，并在分化第14d達(dá)40％的峰值。SSEA-4+細(xì)胞比例從分化0d至70d呈持續(xù)下降)趨勢(shì)，直到90d一直維持于該低水平。
　　3.hESC三維培養(yǎng)

7、第30天，類OC樣組織中的c-kit+/SSEA-4-細(xì)胞P2時(shí)Pax6、Nestin、Sox2陽(yáng)性率分別為47.00％、63.90％、7.27％，隨著細(xì)胞的傳代，各指標(biāo)陽(yáng)性率稍有下降;Ki67陽(yáng)性率在P2、P4、P6代分別高達(dá)75.61％、65.78％、60.80％,細(xì)胞周期檢測(cè)結(jié)果顯示G0/G1期細(xì)胞比例P2時(shí)達(dá)92.5％，后隨傳代而逐漸下降;P3代細(xì)胞經(jīng)定向誘導(dǎo)分化后，免疫熒光染色結(jié)果顯示其可表達(dá)感光細(xì)胞標(biāo)記物Recoverin、

8、神經(jīng)節(jié)細(xì)胞標(biāo)記物Tuj1、及膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物GFAP和GS。
　　結(jié)論:
　　1.hESC H1細(xì)胞系可分化為高表達(dá)Rax的類OV樣組織，以及具有RPE層和神經(jīng)視網(wǎng)膜(neuroretina，NR)層的類OC樣組織;
　　2.三維培養(yǎng)hESC來源類OV、OC樣組織中，c-kit在誘導(dǎo)分化過程中被激活，主要表達(dá)于NR層，c-kit+細(xì)胞比例呈先增高后下降趨勢(shì);SSEA-4早期高表達(dá)于整個(gè)組織，之后逐漸減少并局限于周邊部并維