RASSF6基因在彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤中的甲基化狀態(tài)、mRNA表達(dá)及其臨床意義的研究.pdf

1、目的：非霍奇金淋巴瘤是血液系統(tǒng)惡性腫瘤之一，其中彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤（Diffuse large B-cell lymphoma，DLBCL）是非霍奇金淋巴瘤中最常見的一種類型，約占成人淋巴瘤的一半，是一組具有高度異質(zhì)性的侵襲性B細(xì)胞淋巴瘤，治療方法主要以化療為主。美羅華聯(lián)合化療方案顯著提高了彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤的療效，R-CHOP方案被認(rèn)為是標(biāo)準(zhǔn)治療方案。然而，即便是應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)方案，最終仍有將近40％的患者會復(fù)發(fā)進(jìn)展。因此，彌漫大B細(xì)胞淋巴

2、瘤病因?qū)W研究、基因組學(xué)分析為早期診斷、靶向治療及預(yù)后評估提供了新的方向。
　　彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤的發(fā)生發(fā)展是多基因、多因素共同作用的結(jié)果，因此明確腫瘤相關(guān)基因是早期診斷及后期治療的關(guān)鍵。研究表明，腫瘤的發(fā)生發(fā)展至少包含遺傳和表觀遺傳兩個(gè)層面的調(diào)控，包括癌基因激活、抑癌基因失活等，且表觀遺傳似乎起著更加重要的作用。近年來，表觀遺傳現(xiàn)象在多種腫瘤的發(fā)病機(jī)制中被明確，包括DNA甲基化、組蛋白修飾、染色質(zhì)重塑等。研究證實(shí)RAS相關(guān)區(qū)域家族

3、6基因（RASSF6）是一種抑癌基因，RASSF6的表達(dá)可以通過與K-Ras結(jié)合，協(xié)同抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，且可通過激活JNK信號通路組織細(xì)胞周期進(jìn)展；另外可通過激活caspase通路和其他通路誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。有研究顯示在兒童白血病、胃癌、乳腺癌等腫瘤中出現(xiàn)RASSF6基因啟動子區(qū)高甲基化現(xiàn)象，甲基化是導(dǎo)致RASSF6基因失活的重要原因之一。而RASSF6基因在彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤中的相關(guān)研究尚未見報(bào)道。本研究將通過應(yīng)用甲基化特異性聚合酶

4、鏈反應(yīng)(Methylation-Specific PCR，MSP)和實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(real-time Quantitative Reverse Transcriptase-PCR，QRT-PCR)的方法驗(yàn)證RASSF6在彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤中啟動子區(qū)甲基化狀態(tài)及表達(dá)情況，分析其與樣本資料的關(guān)系，為彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤的發(fā)病機(jī)制、臨床診斷及治療提供一定的理論依據(jù)。
　　方法：
　　1.應(yīng)用MSP方法檢測彌漫大B

5、細(xì)胞淋巴瘤患者和健康人外周血RASSF6基因甲基化狀態(tài)，并分析其與臨床資料之間的關(guān)系。
　　2.應(yīng)用QRT-PCR方法檢測對比彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤患者和健康人外周血中的RASSF6基因 mRNA的相對表達(dá)量，并分析其與臨床資料之間的關(guān)系。
　　3.應(yīng)用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS19.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
　　結(jié)果：
　　1.RASSF6基因啟動子區(qū)在彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤患者和健康人外周血中的甲基化率分別為48.6％(17/

6、35)和14.3%(5/35)。彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤患者RASSF6基因啟動子區(qū)的甲基化率顯著高于健康人，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
　　2.分組分析發(fā)現(xiàn)，在彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤患者中，RASSF6甲基化與Ki-67、LDH、臨床分期相關(guān)(P<0.05)；與患者的性別、年齡、結(jié)外累及、A/B癥狀、生發(fā)中心(Germinal center origin， GCB)或非生發(fā)中心(Non-germinal center origin

7、，Non-GCB)、β2微球蛋白、骨髓累及、IPI均無關(guān)(P>0.05)。
　　3.彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤患者RASSF6基因的mRNA表達(dá)量為0.0415±0.0287，顯著低于健康人mRNA的表達(dá)量0.0634±0.0427，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
　　4.分組分析發(fā)現(xiàn)，彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤患者RASSF6基因mRNA的表達(dá)量與患者的IPI、Ki-67、結(jié)外累及相關(guān)(P<0.05)；與患者的性別、年齡、LDH、A/

8、B癥狀、GCB或Non-GCB、β2微球蛋白、骨髓累及、臨床分期均無關(guān)(P>0.05)。
　　5.彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤外周血中RASSF6基因啟動子甲基化陽性的mRNA表達(dá)量為0.0306±0.0256，甲基化陰性的mRNA相對表達(dá)量平均為0.0518±0.0283，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
　　結(jié)論：
　　1.彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤患者RASSF6基因啟動子甲基化率顯著高于健康人，這表明RASSF6基因啟動子甲基

9、化可能是彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤的發(fā)生機(jī)制之一。
　　2.彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤患者RASSF6基因mRNA的表達(dá)顯著低于健康人，這表明RASSF6基因可能在彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤中起抑癌基因的作用。
　　3.彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤患者RASSF6基因啟動子區(qū)甲基化率與其mRNA表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，提示RASSF6基因啟動子區(qū)甲基化可能是導(dǎo)致彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤患者mRNA表達(dá)減低的原因之一。
　　4.彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤患者RASSF6基因啟動