木犀草素與葉酸對(duì)黃曲霉毒素B1毒性的保護(hù)作用及木犀草素抗癌作用研究.pdf

1、目的：
　　(1)用木犀草素(Luteolin，Lut)及葉酸(Folic acid,FA)干預(yù)經(jīng)黃曲霉毒素B1(Aflatoxin B1，AFB1)染毒的人正常食管上皮細(xì)胞，觀察其對(duì)細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡、亞甲基四氫葉酸還原酶(methylene tetrahydrofolate reductase，MTHFR)基因、葉酸受體1(folate receptor1/a，F(xiàn)OLR1/FRa)基因表達(dá)及MTHFR基因啟動(dòng)子區(qū)甲基

2、化狀態(tài)的影響，探索Lut及FA干預(yù)對(duì)AFB1毒性的保護(hù)作用及其機(jī)制，為L(zhǎng)ut的臨床應(yīng)用及其與FA對(duì)預(yù)防、控制AFB1對(duì)人正常食管上皮細(xì)胞的毒性作用提供一定的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和理論依據(jù)。(2)Lut干預(yù)食管癌Eca109細(xì)胞，探討Lut誘導(dǎo)人食管癌Eca109細(xì)胞凋亡的作用及其作用機(jī)制。
　　方法：
　　(1)AFB1染毒處理對(duì)人正常食管上皮細(xì)胞生理學(xué)的影響:用Cell Counting Kit-8試劑盒(CCK-8)測(cè)定AFB1對(duì)人

3、食管正常上皮細(xì)胞增殖的影響;流式細(xì)胞術(shù)(flow cytometry,FCM)檢測(cè)細(xì)胞周期變化及細(xì)胞凋亡情況。(2)Lut及FA對(duì)AFB1染毒處理的人正常食管上皮細(xì)胞的干預(yù)作用的研究:用Lut及FA干預(yù)AFB1處理的人類正常食管上皮細(xì)胞，CCK8法檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)狀況，F(xiàn)CM檢測(cè)細(xì)胞周期變化及細(xì)胞凋亡情況。(3)Lut及FA對(duì)經(jīng)AFB1染毒的人正常食管上皮細(xì)胞MTHFR、FOLR1基因影響的研究:Real-time PCR檢測(cè)MTHFR、F

4、OLR1mRNA的表達(dá)情況;Western blot檢測(cè)MTHFR、FOLR1蛋白表達(dá)情況;MassArray甲基化定量檢測(cè)細(xì)胞MTHFR基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平。(4)Lut對(duì)人食管癌Eca109細(xì)胞生理學(xué)的影響及其作用機(jī)制的研究:四甲基氮唑藍(lán)(Methyl Thiazolyl Tetrazolium，MTT)法檢測(cè)Lut對(duì)Eca109細(xì)胞增殖的影響;FCM檢測(cè)食管癌細(xì)胞周期和凋亡情況;Real-time PCR檢測(cè)食管癌Eca109細(xì)

5、胞CDK2、CyclinA、Caspase9及Caspase3mRNA的表達(dá)情況;Western Blot檢測(cè)食管癌Eca109細(xì)胞CDK2、CyclinA、Caspase9及Caspase3蛋白表達(dá)水平。
　　結(jié)果：
　　1.AFB1染毒處理對(duì)人正常食管上皮細(xì)胞生理學(xué)的影響:(1)用13μM、25μM、50μM、100μM、200μM AFB1處理人類正常食管上皮細(xì)胞24h、48h、72h，均可以抑制細(xì)胞增殖;(2)FCM

6、周期檢測(cè)結(jié)果顯示，AFB1主要作用于人正常食管細(xì)胞的G0/G1期及S期，50μM、100μM、200μM AFB1處理細(xì)胞24h，G0/G1期細(xì)胞比例明顯升高(p＜0.05)，S期細(xì)胞比例明顯降低(p＜0.05)，細(xì)胞被阻滯在G0/G1期;(3)100μM、200μM AFB1組細(xì)胞凋亡比例明顯高于空白對(duì)照組(p＜0.05)，50μMAFB1組早期凋亡細(xì)胞比例明顯升高(p＜0.05)。
　　2.Lut及FA對(duì)經(jīng)AFB1染毒的人正常

7、食管上皮細(xì)胞的干預(yù)作用的研究:(1)Lut及Lut聯(lián)用FA干預(yù)組細(xì)胞抑制率明顯低于染毒對(duì)照組(p＜0.05)，F(xiàn)A單獨(dú)干預(yù)的效果不明顯(P＞0.05);(2)Lut、Lut聯(lián)合FA干預(yù)組G0/G1期細(xì)胞比例較染毒組明顯降低(P＜0.05)，S期的細(xì)胞所占比例明顯高于染毒對(duì)照組(P＜0.05);FA干預(yù)效果不明顯;(3)Lut、Lut聯(lián)合FA干預(yù)組細(xì)胞凋亡率明顯低于染毒對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　3.Lut及F

8、A對(duì)經(jīng)AFB1染毒的人正常食管上皮細(xì)胞MTHFR、FOLR1基因影響的研究:(1)Real-time PCR檢測(cè)結(jié)果顯示:AFB1染毒24h上調(diào)人正常食管上皮細(xì)胞MTHFR、FOLR1mRNA的表達(dá)(P＜0.05)。經(jīng)Lut干預(yù)后，細(xì)胞MTHFR、FOLR1mRNA的表達(dá)明顯減少(P＞0.05)。用20μM、200μM FA進(jìn)行干預(yù)，細(xì)胞MTHFR mRNA的表達(dá)未受明顯的影響(P＞0.05);而200μM FA組FOLR1mRNA的表

9、達(dá)明顯下降(P＜0.05)，20μM FA組下調(diào)效果不及200μMFA組(P＜0.05）。Lut聯(lián)用FA干預(yù)能明顯減弱AFB1對(duì)MTHFR mRNA表達(dá)的上調(diào)影響(P＜0.05)，Lut聯(lián)用20μMFA組與Lut聯(lián)用200μM FA組對(duì)經(jīng)AFB1染毒的人正常食管上皮細(xì)胞FOLR1mRNA表達(dá)產(chǎn)生不同的調(diào)節(jié)作用(P＜0.05);(2)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，AFB1染毒上調(diào)人正常食管上皮細(xì)胞MTHFR蛋白的表達(dá)(P＜0.05），下調(diào)FOLR1蛋白的

10、表達(dá)(P＜0.05）。經(jīng)Lut干預(yù)后，細(xì)胞MTHFR蛋白表達(dá)減少、FOLR1蛋白表達(dá)增加(P＜0.05)。20μM、200μM FA干預(yù)組細(xì)胞MTHFR蛋白的表達(dá)程度與染毒組相近(P＞0.05);FOLR1蛋白表達(dá)程度接近空白對(duì)照組(P＞0.05)，提示FA對(duì)MTHFR蛋白表達(dá)干預(yù)效果不明顯，對(duì)FOLR1蛋白表達(dá)的干預(yù)效果明顯。Lut聯(lián)用FA干預(yù)能明顯減弱AFB1對(duì)MTHFR、FOLR1蛋白表達(dá)的影響(P＜0.05)。(3)MassAr

11、ray甲基化定量檢測(cè)細(xì)胞MTHFR擴(kuò)增子中的CpG單位的甲基化水平，結(jié)果顯示，CpG_5、CpG_6.7、CpG_16、CpG_35、CpG_42單位的染毒組甲基化水平明顯高于空白對(duì)照組(P＜0.05)。比較Cpg_5和CpG_35位點(diǎn)的甲基化水平，發(fā)現(xiàn)Lut組及Lut聯(lián)用200μMFA干預(yù)組的甲基化水平明顯低于染毒組(P＜0.05），與空白對(duì)照組接近(P＞0.05);CpG_6.7位點(diǎn)，染毒組細(xì)胞甲基化水平明顯高于空白對(duì)照組(P＜0.

12、05)，200μM FA組的甲基化水平明顯低于染毒組(P＜0.05);CpG_16、CpG_42位點(diǎn)，除20μM FA干預(yù)組，其余各干預(yù)組干預(yù)效果明顯(P＜0.05）。
　　4.Lut對(duì)人食管癌Eca109細(xì)胞生理學(xué)的影響及其作用機(jī)制的研究:(1)MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，用Lut濃度為40μM、80μM、120μM、160μM、200μM、240μM處理食管癌Eca109細(xì)胞24h、48h和72h，均可以抑制細(xì)胞增殖(P＜0.05)，

13、且隨Lut濃度的增加，呈倒U型;(2)選用40μM、160μM、240μM為后期實(shí)驗(yàn)干預(yù)濃度，經(jīng)FCM檢測(cè)，Lut濃度為160μM、240μM時(shí)，細(xì)胞阻滯于S期間，并在濃度為160μM時(shí)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，細(xì)胞早凋率明顯增加(P＜0.05);(3)Lut可下調(diào)CDK2mRNA的表達(dá)(P＜0.05），且隨著濃度的增加，Lut對(duì)CyclinA、Caspase9及Caspase3mRNA表達(dá)的作用呈現(xiàn)出先促進(jìn)后抑制的趨勢(shì);(4)Lut可下調(diào)CDK2

14、蛋白表達(dá)(P＜0.05)，對(duì)CyclinA表達(dá)的作用表現(xiàn)為先促進(jìn)后抑制，160μM、240μM Lut組CyclinA蛋白表達(dá)受抑制(P＜0.05），蛋白表達(dá)水平隨劑量的增加而降低。Lut對(duì)Caspase9、Caspase3表達(dá)呈現(xiàn)先增加后抑制的作用趨勢(shì)，240μM Lut組Caspase9、Caspase3蛋白表達(dá)明顯受抑制（P＜0.05）。
　　結(jié)論:
　　(1)AFB1能夠通過(guò)阻滯細(xì)胞周期，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，來(lái)抑制人正常食

15、管上皮細(xì)胞增殖，并存在一定的劑量-效應(yīng)關(guān)系，Lut和FA的干預(yù)能夠減弱AFB1對(duì)人正常食管上皮細(xì)胞的增殖抑制、周期阻滯及凋亡促進(jìn)作用，對(duì)AFB1的毒性作用起到一定的保護(hù)作用。(2)Lut和FA的干預(yù)可以減弱AFB1對(duì)人正常食管上皮細(xì)胞MTHFR、FOLR1mRNA和蛋白表達(dá)的影響，改善細(xì)胞FA代謝，從而發(fā)揮對(duì)人正常食管上皮細(xì)胞的保護(hù)作用;Lut及FA可以減弱AFB1對(duì)人正常食管上皮細(xì)胞的毒性作用，保護(hù)人正常食管上皮細(xì)胞。Lut及FA的干