抗苗勒氏管激素對干細胞因子負調(diào)控分子機制的研究.pdf

1、AMH作為體內(nèi)唯一的抑制始基卵泡生長的細胞因子，由顆粒細胞分泌，從兩個途徑發(fā)揮其生物學作用，一方面AMH與顆粒細胞上特異的Ⅱ型受體(AMHRII)結合，通過胞漿內(nèi)一類Smad3中介蛋白信號轉導至核內(nèi)，抑制了核內(nèi)CYP19基因mRNA的表達，降低細胞色素酶P450的活性而下調(diào)雌激素的分泌，抑制始基卵泡的募集。另一方AMH作為TGF-β家族成員，通過Smad蛋白影響顆粒細胞內(nèi)信號通路中的重要轉錄因子，進而調(diào)控各種細胞因子的表達，減弱了這些細

2、胞因子促進細胞分化、血管生成及延長細胞周期的作用。這可能是AMH抑制卵泡募集的主要途徑。但關于AMH調(diào)控這些細胞因子進而抑制卵泡募集的信號途徑尚無報道，若能突破AMH與卵子之間途徑的研究，掌握AMH調(diào)控此信號途徑的具體分子機制，對于保存和延長人類生育力將有著深遠的意義。
　　干細胞因子(SCF)屬于集落刺激因子(colonystimulatingfactor，CSF)，顆粒細胞產(chǎn)生的SCF通過與卵細胞膜上的自身配體c-kit結合激

3、活PI3/AKT途徑刺激卵細胞及卵泡膜細胞的生長與分化以及類固醇激素的產(chǎn)生，從而加速始基卵泡的生長，因而SCF成為卵巢局部較為重要的生長因子。目前對SCF在卵巢局部促進作用已證實，但關于對SCF在顆粒細胞中表達的調(diào)控機制尚不清楚。
　　EricNilsson通過體外培養(yǎng)大鼠卵巢，發(fā)現(xiàn)AMH可能抑制了SCF促進卵子生長的作用。目前已知AMH和SCF都是顆粒細胞分泌的，AMH的Ⅱ型受體僅位于顆粒細胞上，而SCF的受體位于卵細胞膜，結合

4、上述研究的結論，推測SCF可能是AMH作用于卵子的媒介之一。也提示我們應對AMH與SCF的關系進行進一步的研究。目前已證實AMH則通過自分泌與旁分泌的方式抑制cAMP中CREB的磷酸化，減少雌激素合成酶的轉錄。而SCF啟動區(qū)存在cAMP反應元件CREB的結合位點，且cAMP/PKA途徑可增強SCF的轉錄。根據(jù)前期研究結果和上述文獻，我們推測AMH可能通過抑制cAMP/PKA途徑減弱SCF的轉錄。由此提出研究假設:在顆粒細胞中AMH通過抑

5、制cAMP途徑中CREB的磷酸化，減弱SCF啟動子活性，下調(diào)SCF基因的轉錄，從而減弱SCF促進卵子生長啟動的作用，最終抑制卵泡募集。
　　本研究分為三部分，第一章研究行體外受精-胚胎移植(IVF-ET)患者血清、卵泡液、及顆粒細胞中AMH與SCF蛋白及mRNA表達水平的相關性，第二章采用人黃素化顆粒細胞原代培養(yǎng)，研究不同濃度的AMH對SCF分泌的影響，從細胞水平研究AMH影響顆粒細胞分泌SCF功能的機制。第三章采用cAMP激動劑

6、或阻斷劑(H89)與rhAMH聯(lián)合、單獨處理體外培養(yǎng)人黃素化顆粒細胞，應用RT-PCR技術半定量檢測體外培養(yǎng)人黃素化顆粒細胞SCFmRNA的表達，從分子水平探討AMH是否通過抑制cAMP/PKA途徑影響顆粒細胞SCF分泌過程。
　　第一章AMH與SCF在血清及卵巢局部表達相關性的研究
　　研究對象:
　　選擇2009年1月-2012年9月期間就診于寧夏醫(yī)科大學總醫(yī)院生殖醫(yī)學中心不孕患者共235例，平均年齡32.33±2

7、.46歲，行體外受精體外胚胎移植(IVF-ET)78例，入選研究對象均測量其身高，體重，計算平均體重指數(shù)即體重/身高2(BMI)20.45±1.61，實驗對象的具體篩選標準為:月經(jīng)周期規(guī)律，經(jīng)超聲監(jiān)測合并黃體期孕酮水平檢測證實排卵功能正常，卵泡刺激素水平在正常范圍（月經(jīng)周期第3天FSH＜15IU/1），無多囊卵巢綜合征、高泌乳素血癥及子宮內(nèi)膜異位癥，并排除全身其它系統(tǒng)疾病。
　　研究方法:
　　ELISA檢測不孕癥患者月經(jīng)周

8、期第3天早晨空腹靜脈血清及卵泡液中AMH及SCF蛋白水平;real-timeRT-PCR檢測人顆粒細胞AMH及SCFmRNA水平表達，比較分析二者的相關性。
　　結果:
　　235例患者血清中AMH與SCF蛋白水平無明顯相關性(r=0.57，P=0.33)。其中78例IVF-ET患者中獲得55例卵泡液及31例顆粒細胞。55例卵泡液中AMH與SCF蛋白水平有顯著相關性(r=-0.65;P＜0.05);31例顆粒細胞中AMH與S

9、CFmRNA有顯著負相關(r=-0.79;P＜0.01)。
　　結論
　　1.人黃素化顆粒細胞中AMH與SCFmRNA存在明顯負相關性。
　　2.人卵泡液中AMH與SCF蛋白水平呈明顯負相關性。
　　3.不同卵巢反應患者血清中AMH表達有差異，SCF表達無差異。
　　4.卵巢功能正?；颊哐逯蠥MH與SCF蛋白水平無明顯相關性。
　　第二章AMH對體外培養(yǎng)顆粒細胞分泌SCF的影響
　　研究對象:

10、
　　人黃素化顆粒細胞來自15例因單純男方因素行IVF-ET不孕患者，年齡22-28歲，均選用長方案超排卵，即在月經(jīng)周期的黃體中期皮下注射長效達菲林1.25mg進行降調(diào)節(jié)，于月經(jīng)周期第3天應用高純度卵泡刺激素(FSH-HP)150-450IU/d進行超促排卵，至卵泡直徑至少3個≥16mm，肌注人絨毛膜促性腺激素hCG10000IU,注射hCG36小時后在超聲引導下經(jīng)陰道取卵。COV434細胞購自美國ATCC細胞庫。
　　研究

11、方法:
　　1.人黃素化顆粒細胞的原代培養(yǎng)，按活細胞1.0×105個/ml的密度接種于含10％胎牛血清DMEM培養(yǎng)基的24孔板內(nèi)，培養(yǎng)24小時后更換無血清DMEM，按實驗需要分為4組:空白組、AMH10ng/ml組、15ng/ml組、20ng/ml組。
　　2.利用基因克隆、RNA干擾技術構建pGCsi-shRNA-AMH載體并轉染COV434細胞系，經(jīng)鑒定傳染成功后，繼續(xù)培養(yǎng)72小時，real-timeRT-PCR檢測每組

12、顆粒細胞SCFmRNA表達。免疫組化檢測對照組和實驗組顆粒細胞SCF蛋白。
　　結果:
　　1.實驗組顆粒細胞表達SCFmRNA顯著低于空白對照組(p＜0.05)，其中20mg/mlrhAMH組顯著減少顆粒細胞SCFmRNA表達(p＜0.001)。
　　2.pGCsi-shRNA-AMH載體并轉染COV434細胞系，SCFmRNA及蛋白水平較空白對照組及陰性組顯著增高(p＜0.05)。
　　結論:
　　1.

13、AMH可降低人卵巢黃素化顆粒細胞SCFmRNA及蛋白的表達，隨AMH濃度的增加抑制作用有增強趨勢。
　　2.COV434細胞系經(jīng)干預AMH基因表達后，SCFmRNA及蛋白的表達增多。
　　第三章AMH通過cAMP/PKA途徑對人卵巢黃素化顆粒細胞SCF表達調(diào)控
　　實驗對象:
　　人黃素化顆粒細胞均來自于2013年4月至2013年9月美國東弗吉尼亞醫(yī)學院Jones生殖醫(yī)學研究所(TheJonesInstituti

14、onsforReproductiveMedicineinEasternVirginiaMedicalSchool)進行體外受精-胚胎移植的患者，共37例。年齡26歲-37歲，不孕因素均為輸卵管因素和男方因素。
　　研究方法:
　　采用不同濃度cAMP(1nM，2nM，3nM，4nM)干預體外培養(yǎng)顆粒細胞，篩選出最適濃度;研究在阻斷cAMP/PKA（加入cAMP/PKA抑制劑H89）后AMH對人卵巢顆粒細胞SCF分泌的影響。體

15、外培養(yǎng)人黃素化顆粒細胞分為6組:空白對照組、AMH20ng/ml組、cAMP3nM組、AMH20ng/ml+cAMP3nM、AMH20ng/ml+H89、cAMP3nM+H89組。采用WesternBlot、real-timeRT-PCR及免疫組化等技術檢測體外培養(yǎng)人顆粒細胞中SCF的mRNA及蛋白的表達。
　　結果:
　　1.實驗組顆粒細胞表達SCFmRNA顯著高于空白對照組(p＜0.05），cAMP1nM到3nM組之間有

16、劑量依賴性。cAMP3nM到4nM組比較無顯著性差異(p＞0.05)。
　　2.rhAMH+cAMP組與cAMP組比較，顆粒細胞SCFmRNA、蛋白的分泌減少(p＜0.05);與對照組比較則無差異(p＞0.05）。AMH可抑制cAMP促進人卵巢黃素化顆粒細胞SCFmRNA及蛋白的表達。
　　3.cAMP+H89組與cAMP組比較，顆粒細胞SCFmRNA、蛋白的分泌顯著減少(p＜0.01);與對照組比較則無差異(p＞0.05）