多胺類組蛋白甲基轉移酶DOT1L抑制劑篩選及誘導混合譜系白血病細胞凋亡的研究.pdf

1、混合譜系白血?。∕ixed Lineage Leukemia,MLL），因11q23處MLL基因易位重排形成融合蛋白而得名，是一類致死率極高、預后差的高危惡性急性白血病。DOT1L蛋白是目前發(fā)現(xiàn)的唯一H3K79甲基化轉移酶，也是 MLL白血病的重要靶點，開發(fā)DOT1L小分子抑制劑成為治療MLL白血病的一條新思路。多胺類化合物也因其多靶點性成為抗腫瘤藥物的研究熱點，目前對于DOT1L抑制劑的設計也主要為多胺類衍生物。本課題首先建立組蛋白甲

2、基轉移酶DOT1L抑制劑的虛擬篩選方法，篩選出與DOT1L受體對接評分較高的化合物；設計合成路線合成、分離純化目標化合物，并進行結構確認；最后考察目標化合物對混合譜系白血病細胞的體外活性研究。研究結果如下：
　?。?）根據(jù)實驗室前期研究基礎結合相關文獻資料，設計一系列多胺類衍生物，與正處于一期臨床實驗的陽性化合物EPZ-5676共同構成配體化合物庫，從蛋白質晶體數(shù)據(jù)庫PDB中選取受體模型4HRA。用Sybyl-X2.0軟件將受體與

3、配體進行分子對接試驗，篩選出了分數(shù)最高的化合物DUOA003作為目標化合物；
　?。?）設計合成路線并完成目標化合物DUOA003的合成工作，通過LC-MS、1HNMR，13CNMR確定目標化合物的結構為：N,N'-(propane-1,3-diyl)bis(2,5-dihydroxybenzamide)；
　?。?）以混合譜系白血病細胞MV4-11和巨噬細胞作為研究對象，采用CCK-8法測定兩株細胞在目標化合物和陽性藥物阿

4、糖胞苷不同濃度（120、100、50、25、10、1、0.1μM）作用24h后的增殖抑制率。結果發(fā)現(xiàn)DUOA003和陽性藥物阿糖胞苷對MV4-11細胞均有顯著的抑制作用，IC50分別為25和28μM，對巨噬細胞的IC50分別為71μM和11μM；選擇對正常細胞安全濃度范圍考察不同作用時間24h、48h、72h對細胞抑制作用的影響，結果反映出DUOA003對MV4-11細胞的抑制率展現(xiàn)出時間和劑量的依賴性；
　?。?）采用Annex

5、in V-FITC/PI法對經高、中、低濃度的藥物誘導24h和48h的MV4-11細胞進行染色，在熒光顯微鏡下觀察誘導48h后細胞狀態(tài)，并用流式細胞儀檢測目標化合物誘導MV4-11細胞的凋亡率。結果發(fā)現(xiàn)DUOA003能夠顯著地誘導MV4-11細胞產生凋亡。誘導48h后，與陰性對照組(17.3±5％)相比，DUOA003的低濃度組（53.9±8%）、中濃度組（80.9±9%）、高濃度組（88.5±6%）、以及阿糖胞苷高濃度組（82.6±9

6、%）均呈現(xiàn)顯著性差異（P＜0.001），DUOA003誘導的細胞48h后凋亡多處于晚期，阿糖胞苷誘導的細胞凋亡則主要出現(xiàn)在早期；
　?。?）用Caspase-3活性測定試劑盒，檢測經高、中、低濃度的目標化合物誘導細胞凋亡24h后Caspase-3的活性變化。Caspase-3活性檢測顯示化合物DUOA003在誘導細胞凋亡24后，與陰性對照組Caspase-3活性測定OD值（0.146±0.002）比較，DUOA003的低濃度組（0