Sox-HMG分子標記方法機制及其應用研究.pdf

1、生物的遺傳變異是生物學研究的核心主題，而遺傳標記則是揭示生物遺傳變異信息和規(guī)律的重要工具之一。遺傳標記的發(fā)展體現(xiàn)著生命科學的發(fā)展，這種發(fā)展不僅是技術水平的進步和理論成果的獲取，更是對生命本質(zhì)的認識不斷深化、系統(tǒng)化的反映。DNA條形碼技術是新一代的DNA遺傳標記，它提供了一種快速且廉價的物種鑒定方法，即使是非物種分類學家也可以使用這個工具獲取生物系統(tǒng)學信息。DNA條形碼技術的發(fā)展為新分子標記的開發(fā)提供了重要的思路：選擇核基因區(qū)域，從而避免

2、單性遺傳的線粒體基因在系統(tǒng)發(fā)生分析時的偏向性；最好是具有保守結構域的、含有多個成員的基因家族，實現(xiàn)多基因的交叉驗證；所選擇的目的基因結構區(qū)域應當具有高度保守性，從處于不同的系統(tǒng)發(fā)生譜系的各種不同的動物類群中都能得到擴增。
　　 SOX基因家族成員具有一個編碼80個氨基酸殘基的高度保守的HMG結構域，是一類可以與DNA特異結合的轉錄因子。Sox-HMG分子標記方法通過針對Sox基因HMG域保守序列設計特殊簡并引物，可以從各種不同動

3、物的基因組中擴增獲得具有特定數(shù)目和長度的DNA片段，這些片段構成物種特異的Sox-HMGDNA條帶模式；并進一步通過克隆測序，獲得這些DNA片段特異的DNA序列，從而獲得多水平、交叉驗證的物種特異Sox-HMG分子標記。本研究將具有高度保守結構的基因家族成員作為研究對象，創(chuàng)新性地開展了分子標記研究，為Sox基因研究和分子標記研究提供了可供借鑒的新的思路。通過揭示Sox-HMG分子標記方法的基本原理和作用機制，探討這一全新分子標記方法的適

4、用性和實用性。拓展Sox-HMG分子標記方法應用領域。本文的主要研究內(nèi)容如下：
　　 1.采集屬于不同分類類群的動物物種基因組DNA樣本；利用針對Sox基因HMG結構域保守序列設計的特殊簡并引物，使用PCR技術擴增基因組DNA樣本；利用瓊脂糖凝膠技術，分離PCR產(chǎn)物，獲得各動物物種的Sox-HMGDNA條帶模式；利用PCR產(chǎn)物純化和克隆技術，獲得Sox-HMGDNA序列。
　　 2.對獲得的Sox-HMGDNA序列開展比

5、較分析，結合SSCP技術對Sox-HMGDNA片段進行進一步分離，研究產(chǎn)生Sox-HMGDNA條帶模式多樣性的原因，闡述Sox-HMG分子標記方法作用機制；在揭示Sox-HMG分子標記方法基本原理和作用機制的基礎上，與現(xiàn)有的其他DNA分子標記方法比較分析，主要是與DNA條形碼技術比較，對比討論Sox-HMG分子標記在生物系統(tǒng)學研究、遺傳育種研究和實際應用中的優(yōu)勢。
　　 3.利用Sox-HMG分子標記方法獲得的Sox基因HMG結

6、構域編碼序列構建系統(tǒng)進化樹，開展系統(tǒng)發(fā)生學研究；利用Sox-HMG分子標記方法，在多種動物物種中獲得Sox9基因HMG域DNA序列，對擴增獲得的Sox9基因HMG域序列開展結構分析；對擴增獲得的鯉科魚類Sox9基因HMG域內(nèi)含子開展系統(tǒng)進化討論。
　　 4.使用Sox-HMG分子標記方法在異源四倍體鯽鯉中獲得Sox4基因5’端調(diào)控區(qū)序列；利用PCR擴增、限制性酶切等方法，構建Sox4啟動子重組質(zhì)粒；以綠色熒光蛋白基因為報告基因，

7、通過顯微注射方法，研究Sox4基因在異源四倍體胚胎中的轉錄情況，探討Sox4基因功能。
　　 研究結果證明，Sox-HMG分子標記是一種全新的、基于Sox基因HMG結構域保守序列的DNA分子標記。通過揭示Sox-HMG分子標記方法的基本原理和作用機制，證明了這一全新的方法在各分類類群的不同動物物種系統(tǒng)生物學研究中具有廣泛適用性。并且這一方法特別適用于在遠緣雜交遺傳育種工程研究中，區(qū)別和鑒別具有復雜遺傳背景的不同品系。本研究將具有

8、高度保守結構的基因家族成員作為研究對象，創(chuàng)新性地開展了分子標記研究，為Sox基因研究和分子標記研究提供了可供借鑒的新的思路。利用所獲得的Sox-HMG相關序列，開展了系統(tǒng)進化分析和內(nèi)含子進化研究，證明了這一全新的分子標記方法為系統(tǒng)進化研究提供了豐富的遺傳信息。構建了Sox4-EGFP重組質(zhì)粒，通過顯微注射方法，研究Sox4基因在異源四倍體胚胎中的轉錄情況，探討了異源四倍體鯽鯉Sox4基因功能。同時，進一步證明了Sox-HMG分子標記在基