發(fā)光桿菌中新型雙元毒素細(xì)胞毒性研究.pdf

1、發(fā)光桿菌（Photorhabuds luminescens）是一種兼性厭氧的腸桿菌科細(xì)菌，與昆蟲病原線蟲異小桿屬互惠共生，屬昆蟲病原線蟲共生菌。自然狀態(tài)下，發(fā)光桿菌存在于侵染期線蟲腸道內(nèi)，隨線蟲侵入寄主昆蟲而進(jìn)入昆蟲血腔，在血腔內(nèi)迅速繁殖，產(chǎn)生毒素和抑菌物質(zhì)，使昆蟲患敗血癥死亡。隨著發(fā)光桿菌基因組測(cè)序的完成，該類細(xì)菌中重要功能蛋白和次級(jí)代謝產(chǎn)物的研究越來越受到關(guān)注。
　　 致病桿菌(Xenorhabdus)與發(fā)光桿菌同屬于昆蟲病

2、原線蟲共生菌，兩種細(xì)菌在形態(tài)變異、生存環(huán)境、致病機(jī)理上存在許多相似之處。最近的研究報(bào)道，致病桿菌中xaxAB基因（登錄號(hào):DQ249320）編碼的雙元毒素能引起昆蟲細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞的凋亡，并對(duì)家兔血紅細(xì)胞具有溶血作用。通過分析P.luminescens TT01全基因組序列，發(fā)現(xiàn)plu1961和plu1962基因編碼產(chǎn)物的氨基酸序列與XaxA和XaxB的相似性分別達(dá)到76.8％和74.9％。研究Plu1961和Plu1962的生物活性以及

3、它們?cè)诎l(fā)光桿菌定植、入侵、毒性發(fā)揮中的功能具有重要意義。
　　 本研究從P.luminescens TT01中PCR擴(kuò)增了plu1961和plu1962基因，分別構(gòu)建了單獨(dú)表達(dá)載體pET-plu1、pET-plu2和共表達(dá)載體pET-pluBi。將構(gòu)建的三個(gè)重組質(zhì)粒分別電轉(zhuǎn)至E.coli BL21(DE3)菌株中獲得三株重組菌株:單獨(dú)表達(dá)Plu1961菌株BL21(plu1)，單獨(dú)表達(dá)Plu1962菌株BL21(plu2)和Pl

4、u1961/Plu1962共表達(dá)菌株BL21(pluBi)。經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，三株重組菌中分別表達(dá)可溶性的目的蛋白。利用親和層析純化目的蛋白，并進(jìn)行透析除鹽。將純化的蛋白對(duì)樅色卷蛾中腸細(xì)胞CF-203/2.5進(jìn)行細(xì)胞毒性檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:單獨(dú)加入Plu1961或Plu1962蛋白時(shí)，CF-203細(xì)胞形態(tài)沒有明顯變化，而兩者混合后能引起CF-203細(xì)胞的溶脹、破裂。利用免疫熒光技術(shù)，我們發(fā)現(xiàn)雙元毒素處理24 h的CF-203細(xì)胞出現(xiàn)了微管

5、部分解聚和細(xì)胞膜通透性增加的現(xiàn)象。MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，只有Plu1961/Plu1962混合物才能導(dǎo)致CF-203細(xì)胞死亡，最高致死率達(dá)到94％。殺蟲活性研究表明，Plu1961、Plu1962蛋白單獨(dú)作用時(shí)對(duì)供試?yán)ハx沒有毒性，而Plu1961/Plu1962共表達(dá)產(chǎn)物對(duì)甜菜夜蛾四齡幼蟲具有注射毒性。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:Plu1961/Plu1962是一對(duì)新型的雙元毒素，只有兩者同時(shí)存在的情況下才表現(xiàn)出細(xì)胞毒性和殺蟲活性。
　　

6、為了研究Plu1961/Plu1962雙元毒素對(duì)CF-203細(xì)胞的可能作用機(jī)制，我們采用“Honcest和PI雙染方法”對(duì)毒素處理后的細(xì)胞進(jìn)行了激光共聚焦檢測(cè)。經(jīng)Plu1961/Plu1962雙元毒素處理后的CF-203細(xì)胞中觀察到明亮的紅色和藍(lán)色熒光。同時(shí)，雙元毒素處理后的CF-203細(xì)胞中沒有檢測(cè)到DNA梯狀條帶。這表明Plu1961/Plu1962雙元毒素能夠誘導(dǎo)CF-203細(xì)胞的壞死。
　　 盡管Plu1961和Plu1

7、962體外混合物對(duì)昆蟲中腸細(xì)胞具有很高的毒性，但是對(duì)所測(cè)試的哺乳動(dòng)物腫瘤細(xì)胞沒有明顯作用。但是，當(dāng)Plu1961和Plu1962在大腸桿菌中共表達(dá)時(shí)，對(duì)B16、4T1和Hela表現(xiàn)出較高的細(xì)胞毒性。利用Native-PAGE和質(zhì)譜鑒定，表明Plu1961/Plu1962在大腸桿菌BL21(DE3)中共表達(dá)時(shí)存在相互作用，而這種相互作用是對(duì)腫瘤細(xì)胞毒性必需的。
　　 本研究對(duì)Plu1961/Plu1962新型雙元毒素的殺蟲活性和細(xì)