基于細菌纖維素天然微結構的功能復合材料及其關鍵制備技術研究.pdf

1、細菌纖維素（Bacterial nano-cellulose，簡稱為BNC）是一種由微生物所分泌纖維素納米絲構成的獨特水凝膠。天然BNC水凝膠的納米纖維網絡微結構類似于細胞外基質（Extracellular matrix, ECM）的膠原蛋白絲骨架，同時其還具備高含水、高生物相容性、富羥基表面、高生物活性等諸多優(yōu)良特性，這使得其被認為是一種天生的理想生物醫(yī)用材料，在燒傷敷料、人工血管及骨組織支架等諸多的生物醫(yī)用領域具有廣泛的應用前景。B

2、NC的諸多優(yōu)秀特性（如促進傷口愈合的生物活性、高含水持水特性等），極其依賴其與生俱來的納米纖維網絡微結構。該微結構形成于其特殊的微生物制造過程，其纖維素纖維在纖維細度、聚合度、高度均一性及立體堆砌結構等特性上，是現(xiàn)有人工技術難以達到的。然而，天然的BNC材料仍受到自身原始材料特性的局限，尚不能滿足某些特定應用的功能性要求。特別是：（1）高含水態(tài)凝膠強度和耐縫合強度較低；（2）不具備抗菌特性（3）BNC水凝膠在常規(guī)干燥（風干、熱干燥等）失

3、水后形成的干膠，難以通過再次復吸水實現(xiàn)體積再溶脹。（4）除了天然材料性能上的不足之外，傳統(tǒng)BNC靜態(tài)生產模式，低效、周期長的缺陷極大地限制其工業(yè)化放大生產。
　　現(xiàn)有復合功能化手段通常會破壞天然BNC原本的獨特微結構與特性，從而極大地影響了BNC復合材料的應用效能。如何利用與保護BNC的自身原本的微結構和特性，獲得保留BNC天生結構特性的功能增強材料，是BNC水凝膠基復合材料生產技術研究的關鍵問題。在本研究中，保存與恢復 BNC水

4、凝膠天然微結構特性被作為設計BNC功能增強復合材料的首要考慮因素，并開展了以下四個方面的研究：
　　首先，針對BNC水凝膠基體在高含水態(tài)下強度不足及耐縫合特性弱的缺陷，采用內骨架增強方式保持BNC水凝膠基體原有天然功能與結構，并同時實現(xiàn)材料整體結構強度增強。傳統(tǒng)紡織醫(yī)用紗布雖然存在保水、透氣、促愈功能性不足，但是結構強度較好，且具有較為可靠的生物安全性，是較為理想的內骨架材料。本研究以醫(yī)用棉質紗布（Cotton gauze,簡稱C

5、G）作為織物骨架模型，制備了織物骨架增強的BNC復合材料并對材料的基本理化特性進行了表征。以動態(tài)掛膜方式，研究制備了三種不同凝膠涂層厚度的 BNC-CG骨架增強材料，并將其與CG及靜態(tài)培養(yǎng)10天的BNC膜進行比較。結果發(fā)現(xiàn)，該動態(tài)方式生產的BNC-CG材料的BNC凝膠涂層均一性高，能夠將CG骨架完整對稱的包裹。同時保持了 BNC原本的納米纖維網絡結構及水凝膠屬性。與靜態(tài)培養(yǎng)的BNC水凝膠相比，其含水率有明顯下降，但是仍然超過了98％。在

6、機械性能方面，通過CG骨架增強， BNC基體的拉伸強度及縫合強度均提高了兩個數量級；而對于 CG材料，即使僅有少量的BNC凝膠涂覆，其絕對斷裂強度和吸水能力即能得到極大提高，同時降低斷裂伸長率。該結果表明，織物骨架增強BNC材料的技術，能夠在保留BNC原本屬性的基礎上極大增強強度可靠性；另一方面，對于傳統(tǒng)紗布材料來說，表面涂覆BNC凝膠也是一種極佳的織物特性改造手段，將極大提升傳統(tǒng)紡織紗布的醫(yī)用特性及生物相容性水平。與單純的 BNC凝膠

7、或者 CG材料相比， BNC-CG復合材料在醫(yī)用敷料材料領域具有更好的應用前景。
　　其二，針對傳統(tǒng)細菌纖維素靜態(tài)生產方式低效的缺陷，同時也為了實現(xiàn)既不破壞BNC基體結構，又能完成BNC內的織物骨架植入，本文提出構建一種新的水平旋轉生物反應器，探索了在BNC高效生物制造過程中實現(xiàn)材料復合的動態(tài)掛膜式生產工藝。以一種類似于“凝膠涂層”的生物膜生長過程，將BNC凝膠平整涂覆于織物骨架上，形成織物增強的BNC復合材料。詳細比較研究了動態(tài)

8、掛膜方式與傳統(tǒng)靜態(tài)方式下BNC的培養(yǎng)歷程。結果表明：該動態(tài)掛膜方式能夠將傳統(tǒng)靜態(tài)培養(yǎng)的10天成膜周期縮短至3天。該動態(tài)生長方式通過改善靜態(tài)培養(yǎng)過程的關鍵控制性因素（即其營養(yǎng)物——糖的傳質）提高細菌纖維素的生產效率。但是，實驗顯示該方式下，培養(yǎng)基內的菌群濃度并未明顯提高，且兩種方式的糖利用率、殘余糖濃和 BNC總產量并未明顯變化。為進一步優(yōu)化生產過程，研究比較了傳統(tǒng)靜態(tài)生產方式與水平旋轉反應器的傳質差異，并基于菲克第二定律，建立生物膜的動

9、態(tài)糖擴散模型，對動態(tài)掛膜方式的糖傳質過程及其對BNC生產的影響機制進行了系統(tǒng)闡釋。該模型顯示，糖傳質過程受到糖本身的擴散系數（糖分子決定）、擴散時間（轉鼓轉速和裝液體積共同決定）、培養(yǎng)基的糖濃度等三個因素決定。單個轉鼓周期中，糖向菌膜內擴散的滲透距離由轉速（擴散時間）和擴散系數共同決定，而不受培養(yǎng)基中的殘余糖濃度的影響。通過熒光染色法對菌膜內的菌群分布情況進行了觀察，發(fā)現(xiàn)在離生物膜界面約100μm內存在類似于靜態(tài)培養(yǎng)氣液界面有氧區(qū)的富菌

10、群區(qū)域。研究初步闡明了如何通過水平轉鼓反應器的轉速調控糖傳質過程，繼而影響B(tài)NC生產效率的影響機制：即糖通量的擴散距離過短，會使得有氧區(qū)的菌體無法得到充足的糖補充；而過長的糖通量擴散距離，會使得糖通量擴散進入菌體處于休眠或抑制狀態(tài)下的無氧區(qū)內，因而無法被有效利用。通過不同糖類的轉速優(yōu)化實驗和同種糖類的轉速差速優(yōu)化比較實驗證實了該影響機制。據我們所知，這是首次對動態(tài)掛膜方式下生產BNC中糖傳質影響機制的闡釋。與傳統(tǒng)方式相比，采用水平轉鼓式

11、生物反應器的動態(tài)掛膜生產方式更易于實現(xiàn)工業(yè)化放大生產，具有良好的商業(yè)化應用前景。
　　其三，針對BNC材料自身不具備抗菌特性的不足，本研究通過先在培養(yǎng)基中溶解與纖維素親和性好的抗菌功能高分子，再采用原位復合法，以實現(xiàn)功能高分子在BNC納米纖維絲的胞外組裝過程中摻入纖維素納米纖維內部，形成兩種高分子復合的納米纖維絲。該復合方式可以實現(xiàn)在保留BNC天然微結構、含水特性及凝膠特性的同時，使其獲得抗菌功能性。本研究以具備良好生物相容性及抗

12、菌特性的殼聚糖（Chitosan，CS）作為功能性高分子，并使CS分子在BNC納米纖維“生物組裝”的過程中摻雜入BNC納米纖維內部，繼而進一步通過培養(yǎng)，交織成具備BNC天然微結構的CS/BNC復合納米纖維網絡基體。為實現(xiàn)CS在BNC納米纖維中的高濃度水平摻雜，研究首先采用靜態(tài)培養(yǎng)方式下的原位培養(yǎng)復合，對影響CS摻雜水平的培養(yǎng)基的溶解酸種類、pH條件和滅菌方式進行了篩選及優(yōu)化。結果顯示，采用混合后同步滅菌的乙酸CS原位培養(yǎng)基，能夠較好實現(xiàn)

13、CS/BNC的原位復合目標。CS不僅能成功摻雜入納米纖維的內部形成CS/BNC復合納米纖維，而且在苛刻的堿煮純化后仍能穩(wěn)定存在，CS含量可達復合材料干重的35%-48%。但是，靜態(tài)原位培養(yǎng)技術也暴露出摻雜的抗菌功能材料會抑制BNC生產菌自身合成纖維素活性的缺陷。這導致了靜態(tài)培養(yǎng)條件下，即便在培養(yǎng)基中添加低濃度水平的 CS，其菌體的納米纖維生產量都會極大地下降，且所獲得的BNC納米纖維網絡交織密度遠遠低于未添加CS的對照組，所形成的CS/

14、BNC膜非常薄，強度甚至不能滿足基本力學測試的要求，更無法實際應用。為此，進一步采用已構建的水平轉鼓式反應器，通過動態(tài)掛膜方式進行原位復合培養(yǎng)。結果發(fā)現(xiàn)在動態(tài)方式下，菌體具有較高的活性和對抗抗菌高分子的能力，能夠耐受0.25-0.75 w/v%的CS，生產出與未添加CS對照組相當的凝膠厚度的BNC/CS復合凝膠膜。其中CS/BNC復合材料的CS占到材料干重的40-44%。動態(tài)生產的CS/BNC復合凝膠保留了 BNC原本的納米纖維網絡結構

15、，平均直徑仍然低于100μm，且其纖維密度接近正常對照組，但是受到CS的摻雜濃度水平提高的影響，納米纖維直徑的均一度會降低，直徑分布范圍變寬。通過抗菌測試發(fā)現(xiàn)，動態(tài)掛膜法生產的CS/BNC復合材料對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌均有較好的抗菌能力，且主要表現(xiàn)為靜態(tài)接觸條件下的抑菌性。該動態(tài)生產的CS/BNC復合材料不僅保持了BNC原本的類ECM納米纖維網絡結構，而且具備抑菌和織物骨架增強特性，因此在BNC醫(yī)用復合材料領域具有良好的應用前景。<

16、br>　　最后，由于BNC水凝膠在常規(guī)干燥后無法像多數高分子水凝膠一樣，通過復吸水再次溶脹恢復成水凝膠，并且其三維納米纖維網絡微結構在干燥坍塌后也無法自主恢復，論文對BNC微結構的復水恢復能力進行了改進研究。雖然天然BNC水凝膠失水后幾乎無法復水，但是相比于其他高分子水凝膠在溶脹或退溶脹時表現(xiàn)為各個方向尺寸上（各向同性或各向異性）的三維變化，BNC水凝膠由于獨特的分層式納米纖維網絡結構，在干燥收縮時幾乎僅沿著自身厚度方向一維收縮。而無支

17、撐、高溶脹的一維溶脹水凝膠膜一直是水凝膠及工程材料領域多年求之不得的一種概念上的水凝膠元件，其難以實現(xiàn)的原因在于：已知的現(xiàn)有水凝膠材料或者結構，在無約束狀態(tài)下未能實現(xiàn)大尺度一維體積變化。因此，解決BNC復水及微結構自主恢復的問題，不僅能夠改善天然BNC的性能缺陷，同時也提供了一種制備無支撐一維溶脹水凝膠膜的可能。本論文提出在BNC納米纖維網絡中穿插聚電解質（Polyelectrolyte，PE）的復合方案：利用 PE穿插于BNC納米纖維

18、網絡及沉積于BNC納米纖維表面，使得干燥后層層堆積及互相聚集的BNC納米纖維被PE分子相互隔離；通過PE分子在特定pH下電離產生的靜電斥力，可使BNC納米纖維聚集體相互分開，從而啟動其納米纖維網絡結構恢復及復水溶脹。為證實該設想，論文分別選擇了三種不同類型的PE分子作為研究對象，即陽離子氨基的殼聚糖，具陰離子羧基的羧甲基纖維素，及兼具陰陽離子的羧甲基殼聚糖，分別制備了三種類型各異的PE/BNC復合膜，并對其pH響應的溶脹特性及其一維溶脹

19、性能進行了驗證研究。該PE/BNC復合膜是一類具有pH響應、無支撐、大溶脹率的一維溶脹薄膜材料；其可以在30 min內，從不到10-20μm迅速溶脹至數個毫米；同時在其厚度膨脹約100倍的過程中，該膜的平面尺寸維持不變。另外，本研究以苯甲酸作為模型分子，通過垂直雙室擴散池測定了小分子對PE/BNC膜的透過性能。結果表明該膜具備在溶脹狀態(tài)下接近于零階的控釋性能，而在非溶脹狀態(tài)下能夠讓小分子快速透過。PE/BNC復合膜是世界上目前僅有的幾種