流道網(wǎng)絡(luò)的生物3D打印及其在跨尺度血管制造中的應(yīng)用.pdf

1、生物打印，又稱細(xì)胞打印或器官打印，是組織工程領(lǐng)域應(yīng)用比較廣泛的一種新技術(shù)。其基本原理是將細(xì)胞混合生物材料制成生物墨水，作為打印的原材料，根據(jù)器官模型數(shù)據(jù)，利用三維打印技術(shù)定向控制細(xì)胞沉積，層層累積制造成接近于真實(shí)器官結(jié)構(gòu)的活性組織器官模型。相比于傳統(tǒng)的基于支架的組織工程方法，生物打印具有可以制造出復(fù)雜組織結(jié)構(gòu)、沉積不同類型細(xì)胞、構(gòu)造細(xì)胞梯度環(huán)境等優(yōu)點(diǎn)。由于打印后的結(jié)構(gòu)需要在體外培養(yǎng)，意味著凝膠結(jié)構(gòu)內(nèi)的細(xì)胞必須要能被充分灌注，以滿足生長(zhǎng)因

2、子、氧氣以及其他營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的供應(yīng)。因此，在打印成型的組織結(jié)構(gòu)內(nèi)構(gòu)造用于輸送營(yíng)養(yǎng)的流道網(wǎng)絡(luò)是關(guān)鍵步驟，也是生物打印能否被深入應(yīng)用的一個(gè)挑戰(zhàn)。本文基于海藻酸鈉凝膠的交聯(lián)特性，利用生物打印方法中的擠出成型工藝，提出了凝膠基流道網(wǎng)絡(luò)的制造方法，并將其應(yīng)用于跨尺度血管結(jié)構(gòu)的制造。本文的主要研究?jī)?nèi)容和成果包括:
　　(1)基于海藻酸鈉和氯化鈣“反向滴加法”的交聯(lián)方式，設(shè)計(jì)了可裝配的同軸噴頭，讓氯化鈣在海藻酸鈉的內(nèi)部與之交聯(lián)，利用同軸擠出工藝一次

3、成型出中空凝膠纖維。首先根據(jù)該方法的工藝流程搭建了同軸噴頭輔助的凝膠管道打印裝置;然后系統(tǒng)地研究了打印過(guò)程參數(shù)對(duì)凝膠管道尺寸的影響規(guī)律;并利用小分子染料、綠色熒光蛋白、牛血清蛋白對(duì)凝膠管道進(jìn)行了滲透性實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明凝膠管具有滲透性，有潛力應(yīng)用于營(yíng)養(yǎng)輸送;最后直接打印小鼠成纖維細(xì)胞，細(xì)胞在凝膠管道中呈三維球形生長(zhǎng)。
　　(2)基于海藻酸鈉和氯化鈣漸進(jìn)交聯(lián)的反應(yīng)特性，提出了組織/營(yíng)養(yǎng)通道同步構(gòu)造的生物打印新工藝。該方法通過(guò)控制海藻酸鈉

4、和氯化鈣的交聯(lián)時(shí)序讓相鄰的中空凝膠纖維融合，實(shí)現(xiàn)凝膠支架結(jié)構(gòu)和內(nèi)部流道網(wǎng)絡(luò)的同時(shí)成型。搭建了基于該方法的新型生物打印系統(tǒng)，通過(guò)大量的工藝實(shí)驗(yàn)，解決了凝膠融合工藝，證明了融合后的凝膠結(jié)構(gòu)強(qiáng)度滿足器官打印的要求，后續(xù)的細(xì)胞培養(yǎng)顯示打印的營(yíng)養(yǎng)通道能有效提高細(xì)胞的長(zhǎng)期存活率。由于該方法能在打印組織結(jié)構(gòu)的同時(shí)打印出內(nèi)部的營(yíng)養(yǎng)輸送通道，使得大尺寸器官3D打印成為可能。本方法還可直接應(yīng)用于器官芯片、凝膠基微流控芯片、藥物篩選芯片等領(lǐng)域。
　　(

5、3)常規(guī)血管由成纖維、平滑肌、內(nèi)皮細(xì)胞依次構(gòu)成，同時(shí)血管內(nèi)部還包含有微細(xì)的滋養(yǎng)血管用于營(yíng)養(yǎng)輸送。為了對(duì)血管結(jié)構(gòu)進(jìn)行仿生，提出了一種具有宏微跨尺度流道的血管結(jié)構(gòu)及其制造方法，其中宏觀流道可用于機(jī)械加載，微觀流道可用于營(yíng)養(yǎng)輸送和化學(xué)加載，這種結(jié)構(gòu)可以集成到器官芯片裝置上，來(lái)更好的模擬真實(shí)血管的微環(huán)境。利用上述組織/營(yíng)養(yǎng)通道同步構(gòu)造的生物打印工藝，將未完全反應(yīng)的中空凝膠纖維繞一個(gè)回轉(zhuǎn)體模板進(jìn)行打印，去除模板后，中空凝膠纖維內(nèi)部的徽管道及模板的

6、宏管道構(gòu)成帶有宏微二級(jí)尺度的血管結(jié)構(gòu)。將平滑肌細(xì)胞和成纖維細(xì)胞逐層打印，并將內(nèi)皮細(xì)胞種植在所打印的血管內(nèi)壁上即可獲得跨尺度血管結(jié)構(gòu)。本方法證明了制造出的血管結(jié)構(gòu)能夠滿足后續(xù)機(jī)械加載的要求，血管結(jié)構(gòu)內(nèi)的細(xì)胞在培養(yǎng)一周后的活性超過(guò)90％。另外，為了演示其在組織工程領(lǐng)域的潛在應(yīng)用，我們利用這種血管結(jié)構(gòu)制造了血管循環(huán)流動(dòng)模型、動(dòng)脈手術(shù)模擬器以及細(xì)胞共培養(yǎng)模型。
　　(4)上述方法制造出的跨尺度血管主要用于心血管疾病的致病機(jī)理的體外研究，由

7、于采用的是水凝膠材料，強(qiáng)度無(wú)法滿足動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的長(zhǎng)期灌注要求。為此，我們把支架制造和生物打印結(jié)合起來(lái)，提出了一種跨尺度細(xì)胞支架的制造方法。首先基于FDM的打印工藝制造出了微米尺度的支架，既保證了整個(gè)結(jié)構(gòu)的外形，又提供了強(qiáng)度支撐;然后利用靜電紡絲技術(shù)制造出了納米尺度的支架，營(yíng)造了適合細(xì)胞生長(zhǎng)的納米環(huán)境;接著利用生物打印技術(shù)可控定向沉積細(xì)胞，既營(yíng)造了細(xì)胞的三維培養(yǎng)環(huán)境，同時(shí)利用海藻酸鈉/明膠二次交聯(lián)的方法層層組裝支架形成三維結(jié)構(gòu)。細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)表