nkg2d真核表達(dá)載體的構(gòu)建及其對yt細(xì)胞生物學(xué)功能的影響

1、午 曉群等 N K G 2 D真核表達(dá)載體 的構(gòu)建及其對 Y T細(xì)胞生物學(xué)功能的影響 第 l 2 期 · 分 子 與 細(xì) 胞 免 疫 學(xué) ·N KG 2 D真核表達(dá)載體 的構(gòu)建及其對 Y T細(xì)胞生物學(xué)功能的影響①許曉群 張 建⑦ ④張 彩 游 力 張建華 劉金生 王郡甫 高春義 田志剛⑦( 山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所， 濟(jì)南 2 5 0 0 6 2 )· 8 8 5 ·中國圖書分類號 9 2

2、 ． 1 2文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A文章編號 1 0 0x ( 2 0 o 5 ) 1 2 - 0 8 8 5 ． 0 4[ 摘 要]目的： 建立 N K細(xì)胞受體 N K G 2 D 真核表達(dá)載體， 通過轉(zhuǎn)染 N K細(xì)胞系 Y T ， 初步探討 N K G 2 D分子對 Y T 細(xì)胞系殺傷功 能的增強(qiáng)作用。方法 ： 用 R T - P C R方法從 N K - 9 2 細(xì)胞中調(diào)取 N K G 2 D基因片段 ， 克隆到 p G E M ． TE

3、a s y 載 體并 對克隆 的 D N A片段 進(jìn)行序列分析。用限制內(nèi)切酶 E e o RI 和 B a m HI 消化 p C E M ． TE a s y ／ N K G 2 D重組 質(zhì)粒 ， 分 離 N K G 2 D片段， 并插 入真核表 達(dá)質(zhì) 粒 p E G F P - N 1 的相應(yīng)限制酶位點 ， 酶譜分析鑒定重組表達(dá)載體 p E G F P - N 1 ／ N K G 2 D 。然后經(jīng)脂質(zhì)體 介導(dǎo)轉(zhuǎn)染 C H O細(xì)胞 和

4、 Y T細(xì)胞 。應(yīng)用熒光顯微 鏡觀測、 W e s t e r nb l o t 方法 和免疫 組化染色對轉(zhuǎn) 染細(xì)胞 內(nèi) p E G F P - N i ／ N K G 2 D的 表達(dá)進(jìn)行鑒定 ， M T r 方法觀 察 Y T 細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞的殺傷功能。結(jié)果： R T - P C R擴(kuò)增獲得 6 5 0b p 基因片段， 經(jīng) D N A序列分析證明所獲得的 D N A序列與文 獻(xiàn)報道的 N K G 2 D序列一致。轉(zhuǎn)染 的 C H O

5、細(xì)胞在熒光顯微鏡 下發(fā) 出強(qiáng)綠色熒光 ， W e s t e r nb l o t 分析顯示 重組蛋白能特 異地與抗 人 N K G 2 D 單克隆抗 體結(jié)合 ； 免疫組 化檢測顯示 ， 轉(zhuǎn)染 的 C H O中有棕 色顆粒 ， 證明所 構(gòu)建 的 N K G 2 D真核 表達(dá)載體可 以在細(xì)胞 中 表 達(dá) ； 轉(zhuǎn)染 N K G 2 D真核表達(dá)載體 的 Y T 細(xì)胞對乳腺癌細(xì)胞具有更強(qiáng) 的殺傷效果。結(jié)論： 所 獲得 的表達(dá) N K G 2 D

6、 分子的真核表 達(dá)載體 ， 通過轉(zhuǎn)染 Y T 細(xì)胞 ， 初 步鑒定所 表達(dá) N K G 2 D分子具有生物學(xué)功能 ， 可 以提高 N K細(xì)胞對腫瘤 細(xì)胞 的殺傷活性 。[ 關(guān)鍵詞] N K G 2 D受體 ； N K細(xì)胞 ； 基因轉(zhuǎn)染 ； 真核表達(dá) Co n s t r u c t i o no fNKG2 D e u k a r y o t i ce x p r e s s i o nv e c t o ra n de fe c t

7、o nYTc e l lb i o l o g i -c a lf u n c t i o nX U‰ ， Z H A NGJ ／ a n， Z H AN GC a i ， Y O U 1 2， Z H A N G~a n - Hn a ， 刪 J ／n - S h e n g， WA NGJ u n - F u， G A OC h u n - Y i ，T I A NZ h i - G a n g ． I n s t i t u

8、 eo f B a s i cM e d i c i n e ， S h a n d o n g A c a d e m yo f M e d i c a lS c i e n c e ， J ／ n a n2 5 0 0 6 2 ， C h i n a [ A b s t r a c t ] O b j e c t i v e ： T oe s t a b l i s hN Kc e l lr e c e p t o rN K G

9、2 De u k a r y o t i ce x p r e s s i o nv e c t o ra n di n v e s t i g a t eo nt h ec y t 0c i t yo f N Kc e l lf i n ~Y Tt r a ~ e c t e dw i t hN KG 2 D． M e t h o d s ： A N KG 2 Dg e n ef r a g me n t ，w it h al e

10、 n g t h0 fa b o u t6 5 0b p ，wa sa mp l i f i e df r o m t h eN K一 9 2c ei ll i n eb yR T - P C Ra n dw a ss e q u e n c e d b yc l o n e d t op ~ n idp GE M： TE a s y ．T h er e c o mb i n a n tp l ~mi dp C~ - TE a

11、 s y ／ N KG 2 Dwa sd ig e st e d w it h E c o R 工 a ndB a m H 工， t he nN K G 2 Df r a g m e n t w a s i s o l a t e d a nd i n s e r t e d i n t o t h ec o r r e s p o n d i n gr e s t r i c t i o ns i t eo ne u k a r

12、y o f i ee x p r e s s i o nv e c t o rp E G ·F P - N1 ．T h eL i p o f e c t i nw a su s e dt ot r a n se c tmc omb i mn te u k a r y o 6 ee x p r e s s i o np l a sm i di n t ot heC HO a n dYrc e l l s ．T h ee x p

13、 r e s s i o nl e v e lo fN KG 2 D g e n ei nt m~ e c t e dC HOc ei l sW a s d e t e c t e db yf l u o r e s c e n c e mi c r o s c o p y ，W e st e r n b l o ta n di mmu n o h i s t o e h o m i c a ls t a i n i n g ．

14、 Re s u l t s ： T h e~ n gt ho f e D N Af r a g m e n ta m p l i f i e db yR T - P C Rw a sc o n s i s t e n tw i t ht h a t0 fN K G 2 D ． D N As e q u e n c i n g 0 fp G E M — TE a s y ／ N K G 2 Dr e v e a l e d t h a

15、 tt h ec l o n e dDN As ~ q u e n c e w a si d e n t i c a lt ot h a t0 fr e p o r t e d N K G2 D． T h ee e nf l u o r e s c e n c e c o u l db es e e ni nt r a n s f e c t e d C HOc el l su n d e r f l u o —r e s c

16、 c n e em i c r o s c o p e ．W e s t e r n b l o ta n di mmu n o h i s t o c h e m i c a ls t a i , ~ ~ d e t e c t i o ns h o w e d t h a tNK G 2 De x pr e s s e di nt r a n s f e c t e dc el l s ．T r a n s f e c t e

17、 dY Tc e l l sh a v es t r o n g e re y t o t o x i c it ya g a i n s tt u mo rc ei l． Co n du s i o n ： N K G2 De u k a r y o a ee x p r e s s i o nv e c t o rs h o w e d b i o l o g i c a lf u n c t i o nb yt r a n s

18、 f e e t —e d i n t oN K c ei ll i n e - Y Ta n dc o u l di n c r e a s eY Tc y t o l y f i ea c t i v i t y ．[ K e yw o r d s ] N K G 2 Dr e c e p t o r ； N Kc e i l ； G e n et r a n s f e c f i o n ； E u k a r y o f

19、i ce x p r e s s i o nN K G 2 D是近年來發(fā) 現(xiàn)的表達(dá) 于 N K細(xì)胞 、 N K T細(xì)胞 、 7 K I ' 細(xì)胞及 C D 8 ( +)細(xì)胞等效應(yīng)細(xì)胞表面 的 N K細(xì)胞受 體， 是 N K細(xì)胞識別靶細(xì)胞 的一種主 要結(jié)構(gòu) “ 。由于腫瘤細(xì)胞不表達(dá)或低表達(dá) M H C ． I①本文受國家 自 然科學(xué) 基金項 目( 3 0 3 7 1 3 0 2 、 3 0 4 7 1 5 2 ) 和山東 省 自

20、然 科學(xué)基金資助項 目( Y ~ m C Z 4 ) 資助 ②山東大學(xué)藥學(xué)院， 濟(jì)南 2 5 0 0 1 2③通訊作者 作者簡介 ： 許曉群 ( 1 9 7 5 年 一) ， 男 ， 碩士 ， 助理研究員 ， 主要 從事基因 工程和分子免疫學(xué)研究。類分子 ， 使得腫瘤特異性 M H C限制性細(xì)胞毒性 T 細(xì) 胞( C T L ) 不能發(fā) 揮作用。在這種 情況下 ，識別非 M H C ． I 類分子的 N K G 2 D在介導(dǎo) N K細(xì)胞

21、識別并溶 解腫瘤細(xì)胞及感染細(xì)胞的免疫應(yīng)答中可能發(fā)揮關(guān)鍵 作用L 2 】 。近年來 ， 對于 N K細(xì)胞的分化發(fā)育 、 識別殺 傷和功能調(diào)節(jié)的分子機(jī)制的研究 日 益引起重視。我 們 旨在構(gòu)建 N K G 2 D基因的真核表達(dá)載體并轉(zhuǎn)染 N K細(xì)胞系， 為進(jìn)一步研究 N K G 2 D如何在 N K細(xì)胞 中發(fā) 揮效應(yīng)功能及其腫瘤生物治療的應(yīng)用提供一種研究 工 具 。維普資訊 http://www.cqvip.com 午 曉群等 N K G

22、2 D 真核表達(dá)載體的構(gòu)建 及其對 Y r 細(xì)胞生 物學(xué)功能的影響 第 1 2 期 E c o RlB a mHlIE c o R lIB a mHlE c o R I_PG．FP · NN／ N K G 2 D5 3 5bpi f - E GF P ] ／ K a nN e o r ／ ／HIE ． 1?1D川 r圖 1 重組質(zhì)粒 p E G F P ． N 1 ／ N K G 2 D構(gòu)建示意 圖№ ． 1S c h e m

23、a t i cc o n s t r u c t i o no fp l a s mi dp E G F P - N1 ／ N KG 2 D圖 2 重組質(zhì)粒 p E G F P - N 1 ／ N K G 2 D的酶切鑒定 № ． 2R e s t r i c t i v ee n z y med i g e s t i o na n a l y s i so fr e c o m b i n a n tp l a s mi dp E

24、GF P ． N1 ／ NKG2 D N o t e ： 1 ． N K G 2 Dg e n ef r , ~ T n o nt ； 2 ． p E G F P - NI ／ N K G 2 Dd i g e s t e dw i t hE c o RIa n dB a n l HI： 3 ． p CE M ． TE a s y ／ N K G 2 Dd i g e s t e dt hE c o RIa n dB a mHI； 4

25、． 1k bD N Am a r k e r ．圖3G F P 在 C H O中的表達(dá) ( × 2 0 0 )№ ． 3E x p r e s s i o n o fG F Pi nC H O s ( × 2 0 0 )No t e ： CHO st r a n s f e c t e db yp E GF P - NI ／ NK G2 D a f t e r2 4h o u r s ．kDa6 0 — 5 0

26、— —4 0— 2 5 — 2 0一 l 5一 · 8 8 7 ·2 8圖 4We s t e r nb l o t 鑒定 N K G 2 D重組蛋白 № ． 4A n a l y s i so fr e c o mb i n a n tp r o t e i n N K G 2 Db yWe s t e r nb l o tN o t e ： 1 ． P r e - s t a i n e d p r o t

27、e i nl a d d e r ； 2 ． N o n · t r a n d e c t e dC H O s ； 3 ． C H O st l ' d B $ ·f &t e db yp E G F P - N I ／ N K G 2 D．A B 圖 5 免疫 組化染色檢測 N K G 2 D在 C H O中表達(dá) ( × 2 0 0 )№ ． 5D e t e c t i o n

28、o f N K G 2 De x pr e s s i o n i n C HO sb yi l ' I , d n u n o -h i s t o c h e m i c a ls t a ~ l g ( ×2 0 0 )N o t e ： A ． C H Ot r a n s f e c t e d b ye m p t yp l a s mi d ； B ． C H Ot r a n d e c t e

29、 db yp E G } 3 ~ -NI ／ NK G2 D．圖 6N K G 2 D對 Y T細(xì)胞殺傷 O MD A 2 3 1 乳腺癌細(xì)胞的影響№ ． 6I n f l u e n c eo fN K G 2 Do nY T曲 a g a i n s tO M·DA2 3 1c el l s2 ． 3N K G 2 D真 核 表 達(dá)載 體 轉(zhuǎn)染 的 C H O細(xì) 胞 中N K G 2 D表達(dá)水平的鑒定 ①綠色熒光鑒定 ：