定量分析樣品的前處理

1、1,第四章藥物定量分析與分析方法驗證,2,定量分析樣品的前處理方法定量分析方法的特點藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗證生物樣品分析方法的基本要求,3,第一節(jié) 定量分析樣品的前處理方法,采用一定的方法,使待測藥物或待測元素轉(zhuǎn)化為適宜的狀態(tài)后,再進(jìn)行分析測定。,分析樣品前處理,前處理對象,4,前處理樣品分類,有機(jī)鹵素藥物,1.鹵素與脂肪鏈的碳原子相連---結(jié)合不牢固,1.金屬離子不直接與碳原子相連,在溶液中可直接離解出金屬離子。---含金

2、屬有機(jī)藥物 2.金屬離子直接與碳原子以共價鍵相連.結(jié)合狀態(tài)比較牢固,在溶液中不能直接離解出金屬離子。---有機(jī)金屬藥物,含金屬有機(jī)藥物,2.鹵素與芳環(huán)相連---結(jié)合牢固,5,根據(jù)鹵素或金屬在分子中結(jié)合牢固程度不同處理方法而異。,8,鹵素結(jié)合于芳環(huán)上,由于分子碘的結(jié)合較牢固,需在堿性溶液中加還原劑（如鋅粉）,加熱回流,使碳-碘鍵斷裂,形成無機(jī)碘化物后測定。,(三)經(jīng)氧化還原后測定法,（1）堿性還原后測定,如:泛影酸（鹵素原子與芳環(huán)相連,

3、化學(xué)鍵牢固）,9,+3NaI+2CH3COONa+3Na2ZnO2+3H2O,Zn粉,NaI+AgNO3 AgI +NaNO3,,,,,曙紅鈉為吸附指示劑,黃色,玫瑰紅色,,10,①　硝酸-高氯酸法,1.濕法破壞法,破壞力強(qiáng),不適于含氮雜環(huán)，適用于血、尿、組織等生物樣品的破壞，有機(jī)金屬藥物經(jīng)破壞后，得到的無機(jī)金屬離子,一般呈高價態(tài)。,②　硝酸-硫酸法,適用于大多數(shù)有機(jī)物質(zhì)的破壞，破壞得到的無機(jī)金屬離子

4、均為高價態(tài)。不能用于含堿土金屬有機(jī)藥物的破壞。,有機(jī)破壞方法,11,③　硫酸-硫酸鹽法,本法是往樣品中加入濃硫酸作氧化劑，加入硫酸鹽提高硫酸的沸點，增強(qiáng)硫酸的氧化破壞能力，且防止硫酸的分解損失。,凱氏定氮法,12,,,H2SO4：氧化劑和炭化劑。消解一般在通風(fēng)櫥中進(jìn)行。,K2SO4：提高H2SO4沸點， 縮短消解時間,CuSO4：催化劑，使消解速度加快,消解產(chǎn)物：(NH4)2SO4、NH4HSO4,13,1.取樣量:含金屬元素在10 ~

5、 100?g范圍內(nèi),取樣10g；生物樣品—血10 ~15ml;尿50ml2.所用儀器凱氏燒瓶3.空白試驗4.通風(fēng)櫥中進(jìn)行,注意事項,14,,2.干法破壞,適用于含鹵素、S、P等有機(jī)藥物分析的前處理，也用于某些藥物中Se及砷鹽的檢查。,（1）高溫?zé)胱品▽⒂袡C(jī)物置坩堝內(nèi),灼燒灰化以達(dá)到分解目的。 加無水Na2CO3、硝酸鎂、氫氧化鈣或ZnO以助灰化。,15,（2）氧瓶燃燒法,氧瓶燃燒法是將有機(jī)藥物放入充滿氧氣的密閉燒瓶中進(jìn)行燃燒,

6、并將燃燒所產(chǎn)生的欲測物質(zhì)（氣態(tài)）吸收于適當(dāng)吸收液中,然后根據(jù)欲測物質(zhì)的性質(zhì),采用適當(dāng)分析方法進(jìn)行鑒別、檢查或含量測定。,16,特點：,① 快速分解有機(jī)藥物的簡單方法。,② 不需復(fù)雜設(shè)備,能使有機(jī)結(jié)合中的待測元素定量地分解成無機(jī)離子狀態(tài)。,③ 適用于含鹵素及硫、磷、硒等藥物的鑒別、檢查和含量測定,特別適用于微量樣品的測定。,17,,儀器裝置,18,容量大小隨樣品量而定,一般500ml、1000ml。,※ 含氟藥物用石英制或聚氯乙烯制的燃燒

7、瓶,因樣品燃燒后,產(chǎn)生HF,對玻璃有腐蝕作用,與玻璃中的硼生成氟化硼,BF3在水中不能完全解離,而使測定結(jié)果偏低。,① 硬質(zhì)玻璃碘瓶,19,鉑絲下端做成螺旋狀,長度約為瓶身的2/3。,② 瓶塞底部熔封一根鉑絲,20,②加吸收液﹑通氧,③燃燒,④吸收,⑤測定,,①取樣10-20mg,操作,21,①充氧氣要充分,使樣品燃燒完全,一般急速通氧氣1~2分鐘,燃燒完全時沒有黑色炭化物。,注意事項,③防爆 樣品燃燒時,溫度很高,燃燒瓶內(nèi)壓力很大

8、,有爆炸的可能性,必須采取防護(hù)措施。,,22,①氟化物、氯化物,氟或氯以離子狀態(tài)存在,吸收后可直接測定.,,吸收液的選擇,23,溴化物或碘化物,燃燒后以多種價態(tài)存在,吸收后應(yīng)轉(zhuǎn)化為統(tǒng)一價態(tài)再測定.,③碘化物,②溴化物,24,,測量含溴藥物，可在水-氫氧化鈉吸收液中中加入還原劑二氧化硫飽和溶液。測量含碘藥物，可在水-氫氧化鈉吸收液中中加入溴-醋酸溶液。,25,問題：如何選擇含硫、磷藥物的吸收液？,,26,燃燒?吸收?加溴?加甲酸加KI

9、 ?滴定,實例-碘苯酯的含量測定,27,將? - 氧化為? O3 2Na? + Br2= 2NaBr + ? 2 ? 2+ 5Br2+ 6H2O = 2H?O3 + 10HBr,2 溴-醋酸氧化劑：,? 2+2Na2S203 ? 2HNa? +Na2S403,4 加KI ?滴定 K ? + ? O3 ? 3? 2 +H2O,R-? ? ? CO2+ H2O + Na? + Na?O3,1 燃燒?吸收,O,3

10、加甲酸：除去過量的溴,NaOH,28,第二節(jié) 定量分析方法的特點,一、容量分析法（一）容量分析法的特點,優(yōu)點:準(zhǔn)確度較高（相對誤差不大于0.2%）、精密度好、儀器設(shè)備簡單、實驗成本低、操作簡便、快速。缺點：專屬性不高。適用性：多用于原料藥的含量測定,29,1.滴定度（T）： 每1ml規(guī)定濃度的滴定液相當(dāng)于被測物質(zhì)的質(zhì)量(mg),（二）容量分析法的計算,30,3.百分含量的計算（1）直接滴定法,W：供試品取樣量,設(shè)至終

11、點時，消耗滴定液體積為V ml則藥物實測質(zhì)量為V·T,濃度校正因數(shù),31,例:司可巴比妥鈉的含量測定:取本品0.1g,置250mL碘量瓶中,加水10mL,振搖溶解,精密加溴滴定液(0.05mol/L)25mL,再加鹽酸5mL,密塞,暗處放置15min,加碘化鉀試液10mL,搖勻,用硫代硫酸鈉(0.1mol/L)滴定,做空白校正.已知:司可巴比妥鈉M=260.23;司可巴比妥鈉與溴反應(yīng)的摩爾比為1:1,；供試品的稱取量W=0

12、.1022g,硫代硫酸鈉(0.1mol/L)濃度校正因子F=1.038;供試品滴定消耗硫代硫酸鈉15.73ml；空白試驗消耗硫代硫酸鈉滴定液23.21ml。計算：溴滴定液（0.05mol/L）的滴定度,32,33,（2）間接滴定法 1）生成物滴定法 藥物 + A → B 滴定 2）剩余滴定法（回滴法） 藥物 + A（定、過量） →····

13、;············ 剩余的 A + B →·······（回滴）······V 空白試驗····

14、3;····································&#

15、183;·V0,,滴定劑,34,,,（一）紫外—可見分光光度法,二.光譜分析法,2.原理：根據(jù)Lambert—Beer定律 A = ECL E：吸收系數(shù) C:單位濃度 L:液層厚度,1.特點： （1）靈敏度高，可達(dá)10-4 g/ml～10-7 g/ml （2）準(zhǔn)確度高，相對誤差為2%～5% （3）儀器價格較低廉，操作簡單，易于普及,35,,,,①摩爾吸收系數(shù)（ε）：指在一定波長下,溶液

16、濃度為1mol/L，厚度為1㎝時的吸收度。②百分吸收系數(shù)（ ）：指在一定波長下,溶液濃度為1%（W/V），厚度為1㎝的吸收度。,.,③ε與E關(guān)系,強(qiáng)吸收度：ε=104~105 弱吸收度：ε<102中強(qiáng)吸收：ε=102~104,36,波長的校正：汞燈中的幾根較強(qiáng)的譜線或用儀器自身 所帶的氘燈的特定譜線為參照進(jìn)行校正 吸收度準(zhǔn)確性的檢定：重鉻酸鉀的硫酸溶液，規(guī)定波

17、 長處測定Ｅ ，應(yīng)符合規(guī)定。 雜散光的檢查：一定濃度的碘化鈉和亞硝酸鈉溶液， 規(guī)定波長處測定透光率，應(yīng)符合規(guī)定。,3.儀器的校正和檢定,37,規(guī)定溶劑和吸收池的吸收度在220nm～240nm范圍內(nèi)不超過0.4 ；在241nm～250nm范圍內(nèi)不得超過0.2；在251nm～300nm范圍內(nèi)不得超過0.1；在300nm以上不得超過0.05。,4.對溶劑的要求,38,5.測定方法,（1）對照品比較

18、法（2）吸收系數(shù)法（3）計算分光光度法,一般供試品的吸收度應(yīng)為0.3～0.7,39,A供／A對＝C供／C對,制劑：,原料藥：,（1）對照品比較法,40,例：維生素B12的含量測定 精密吸取B12注射液2.50mL，加水稀釋至10.00mL；另配制對照液，精密稱定對照品25.00mg，加水稀釋至1000mL。在361nm處，用1cm吸收池，分別測定吸光度為0.508和0.518，求B12注射液注射液的濃度以及標(biāo)示量的百分含量（

19、該B12注射液的標(biāo)示量為100μg / mL）,41,（2）吸收系數(shù)法,注意： 應(yīng)>100,42,例：精密稱取B12樣品25.0mg，用水溶液配成100ml。精密吸取10.00ml，又置100ml容量瓶中，加水至刻度。取此溶液在1cm的吸收池中，于361nm處測定吸光度為0.507，求B12的百分含量？,43,差示分光光度法雙波長分光光度法三波長分光光度法,（3）計算分光光度法,（4）比色法 特點： 加

20、入顯色劑后，按照對照品比較法測定，影響顯色因素很多，故需注意平行操作。,44,,(二)熒光分析法,⑴ 原理：物質(zhì)在受到激發(fā)光（λex）照射后產(chǎn)生了較長波長的熒光（λem）。,溶液的熒光強(qiáng)度和溶液的吸光程度、溶液中熒光物質(zhì)的熒光效率等因素有關(guān)。,45,(2)特點,靈敏度高,可達(dá)10-10g/ml～10-12g/ml.多在低濃度進(jìn)行.應(yīng)用范圍窄.取樣少,方法快速.,46,,,(3)含量測定：,對照品比較法,,47,,,③ 說明,a.

21、藥物本身無熒光：加衍生試劑（熒胺、鄰苯二甲醛（OPA）丹酰氯）,使成熒光物質(zhì)后測定。,b.熒光測定影響因素多：溶劑、pH值、散射光、熒光物質(zhì)濃度故做空白試驗，不易測得絕對熒光強(qiáng)度。,48,高效液相色譜法基本原理,1.定義：,三、色譜分析法,（一）高效液相色譜法,2.液相色譜分離原理,根據(jù)各組分在固定相及流動相中的吸附能力、分配系數(shù)、離子交換作用或分子尺寸大小的差異進(jìn)行分離。 色譜分離實質(zhì)是樣品分子與溶劑以及固定相分子間的作用。,

22、49,3.基本術(shù)語,保留時間和調(diào)整保留時間tR,保留時間tR： 從進(jìn)樣開始到某組分色譜峰頂（濃度極大點）的時間，即組分在色譜柱中的停留時間或組分流經(jīng)色譜柱所需要的時間。 死時間t0或tm： 分配系數(shù)為零的組分的保留時間，即組分在流動相中的停留時間或流動相流經(jīng)色譜柱所需要的時間（又稱流動相保留時間）。,50,保留因子κ 是溶質(zhì)在固定相中的分子數(shù)與流動相中的分子數(shù)的比率。,分離度R,分離因子α

23、 又稱選擇性。 α= κ2/ κ1,51,理論塔板數(shù) 經(jīng)典的色譜理論將色譜分離過程看作一系列相繼的平衡過程，每一平衡過程稱之為一個理論塔板，即把色譜柱假象成由許多板組成，在每一板上，成分在兩相間建立一次平衡。,52,峰不對稱性T 峰不對稱性在藥典中稱拖尾因子T。,拖尾：某些分子與固定相分子由于氫鍵等分子間作用力而強(qiáng)烈保留，這些分子將落后于主峰，成為譜峰尾部。前伸：由于某些分子因固定相對

24、其較少保留而移向主峰帶之前。,53,高效液相色譜儀由 高壓輸液系統(tǒng)、進(jìn)樣系統(tǒng)、分離系統(tǒng)、檢測系統(tǒng)、記錄系統(tǒng) 等五大部分組成。,4.組成,54,流動相,真空脫氣機(jī),四元泵,自動進(jìn)樣器,紫外檢測器,熒光檢測器,蒸發(fā)光散射檢測器,55,自動進(jìn)樣器,56,四元泵,57,色譜柱,填充劑常用：十八烷基硅烷鍵合硅膠,58,（2）進(jìn)樣裝置 1）隔膜進(jìn)樣（高分子有機(jī)硅膠墊→進(jìn)樣室） HPLC系統(tǒng)壓力太大，必須停泵進(jìn)樣（早期） 2）閥進(jìn)樣：

25、不必停泵，六通閥,（3）色譜柱：直徑4~6mm,柱長10~30cm 柱效評價：色譜系統(tǒng)適應(yīng)性試驗 柱再生：維護(hù)、保養(yǎng)、柱子的沖洗,（1）泵：恒壓泵：流量精度不穩(wěn)；恒流泵：常用,59,1）紫外檢測器（UV）：適于吸收紫外光的物質(zhì),（4）檢測器,可變波長紫外檢測器：采用氘燈做光源，波長在190～600nm范圍內(nèi)可連續(xù)調(diào)節(jié)。,60,二極管陣列紫外檢測器(DAD)： 用陣列二極管同時測定各種波長的光強(qiáng)度。采用計算機(jī)快速掃描采

26、集數(shù)據(jù)，可得三維的色譜-光譜圖象。所得信息為吸收隨時間和波長變化的三維圖或輪廓圖，從輪廓圖可以容易地選擇測定各個分析物的最佳波長。,61,2）熒光檢測器（FL）：只能分析自身發(fā)光的物質(zhì)，靈敏度高3）示差折光檢測器(RI)：利用折光率的差別，靈敏度低，溫度要求嚴(yán)格4）電化學(xué)檢測器（ECD）：主要用于離子色譜。,,62,原理：色譜柱后流出物被高速載氣（N2）噴成霧狀液滴，在受溫度控制的漂移管中，流動相不斷揮發(fā)，溶質(zhì)形成不揮發(fā)的微小顆粒，

27、被載氣攜帶通過檢測系統(tǒng)。通過測定散射光的強(qiáng)度來確定溶質(zhì)的濃度。優(yōu)點：消除了溶劑的干擾和因溫度變化引起的基線漂移，尤其適用于梯度洗脫。,5）蒸發(fā)光散射檢測器（ELSD）：用于在揮發(fā)性流動相中測定非揮發(fā)性成分。,63,6.高效液相色譜的固定相和流動相,高效液相色譜固定相以承受高壓能力來分類，可分為剛性固體和硬膠兩大類。1.剛性固體: 以二氧化硅為基質(zhì),可承受7.0?108~1.0?109Pa的高壓，可制成直徑、形狀、孔隙度不

28、同的顆粒。如果在二氧化硅表面鍵合各種官能團(tuán)，可擴(kuò)大應(yīng)用范圍，它是目前最廣泛使用的一種固定相。,固定相,64,硅膠填料：硅膠為基質(zhì)的填料HPLC中用的最為普遍.優(yōu)點： 1.機(jī)械強(qiáng)度好，可以填充成穩(wěn)定、高效的填充床，在長期高壓操作下不變形，柱壽命長。 2.比其它材料的柱有更高的柱效。缺點： 1.高PH值下會溶解， PH＞8時會溶解崩床。 2.表面酸性,65,,鍵合硅膠：許多鍵合相填料是由下述反應(yīng)制備的單體結(jié)構(gòu)。,正-十八硅烷鍵合

29、相制成的色譜柱（ODS，C18）庚烷鍵合相制成的色譜柱（C8）氰丙基二甲基硅烷鍵合相制成的色譜柱稱為氰基柱丙氨基硅烷鍵合相制成的色譜柱稱為氨基柱,66,,硅膠基質(zhì)鍵合相的穩(wěn)定性與硅膠和鍵合相類型、流動相PH、緩沖鹽及有機(jī)溶劑性質(zhì)有關(guān)。溫度的增高、 PH值的降低、流動相中含水量的提高會使硅膠上的Si-O- Si鍵水解，因而使鍵合相流失。,優(yōu)點：柱效高缺點：對流動相PH值范圍及組成有一定限制（通常為PH=2～8）。,67,2.硬膠主

30、要用于離子交換和尺寸排阻色譜中，它由聚苯乙烯與二乙烯苯基交聯(lián)而成。可承受壓力上限為3.5?108Pa。固定相按孔隙深度分類，可分為表面多孔型和全多孔型固定相。,68,流動相,（1）溶劑對于待測樣品，必須具有合適的極性和良好的選擇性。（2）溶劑與檢測器匹配。,高效液相色譜中流動相是液體，它對組分有親合力，并參與固定相對組分的競爭，因此，正確選擇流動相直接影響組分的分離度。,對流動相溶劑的要求：,69,（3）高純度 不純的溶劑會

31、引起基線不穩(wěn)，或產(chǎn)生“偽峰”。,（5）低粘度（粘度適中） 若使用高粘度溶劑，勢必增高壓力，不利于分離。常用的低粘度溶劑有丙酮、甲醇和乙腈等；但粘度過低的溶劑也不宜采用，例如戊烷和乙醚等，它們?nèi)菀自谏V柱或檢測器內(nèi)形成氣泡，影響分離。,（4）化學(xué)穩(wěn)定性好,70,7.分類根據(jù)分離機(jī)制不同，液相色譜可分為：,液固吸附色譜分配色譜化合鍵合色譜離子交換色譜分子排阻色譜等類型。,71,以峰高或峰面積定量,1.峰面積的測量2.定

32、量校正因子 3.定量方法,8.高效液相的定量方法,72,定量校正因子,1.兩種表示方法絕對校正因子相對校正因子,相同量的同種物質(zhì)對不同檢測器響應(yīng)不同；相同量的不同種物質(zhì)對同一檢測器響應(yīng)不同。不可以直接用m（或C ） ∝A定量。,73,—絕對校正因子（與組分性質(zhì)、儀器靈敏度有關(guān)）,—進(jìn)入檢測器的物質(zhì)的量或質(zhì)量,74,---相對校正因子與操作條件無關(guān),75,2．相對校正因子的測定,3.注意事項：相對校正因子與待測物、基準(zhǔn)物和檢測器類

33、型有關(guān)，與操作條件（進(jìn)樣量）無關(guān),過程：精稱i純品＋基準(zhǔn)物s→混勻進(jìn)樣→測,76,,,1.系統(tǒng)適用性試驗,①色譜柱的理論板數(shù)（n）,在選定條件下，注入供試品溶液或所規(guī)定的內(nèi)標(biāo)物，記錄色譜圖，按下式計算。,定量方法,77,,,② 分離度（R）,,,R應(yīng)大于1.5,討論：,78,③ 拖尾因子,④重復(fù)性,取各品種項下的對照溶液,連續(xù)進(jìn)樣5次,除另有規(guī)定外,其峰面積測定值的相對標(biāo)準(zhǔn)差應(yīng)≯2.0%。,79,,,2.測定法,（1）內(nèi)標(biāo)法加校正因子：

34、,方法：按規(guī)定配置對照品溶液CR 、內(nèi)標(biāo)物質(zhì)溶液Cs ，注入色譜儀，記錄色譜圖。測定對照品的峰面積AR和內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的峰面積As，計算校正因子。,取含有內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的供試品溶液，注入色譜儀，記錄色譜圖。測定供試品中待測組分和內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的峰面積（或峰高），按下式計含量。,80,對照液（R）： AR CR,峰面積 含量,內(nèi)標(biāo)液（S）： AS CS,供試液（X）： AX

35、 CX,,f= ————,AS/CS,AR /CR,,f= ————,A’S / C’S,Ax /Cx,,Cx=f· ————,Ax,A’S / C’S,81,a．內(nèi)標(biāo)物須為原樣品中不含組分b．內(nèi)標(biāo)物與待測物保留時間應(yīng)接近且R>1.5c．內(nèi)標(biāo)物為高純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，或含量已知物質(zhì),對內(nèi)標(biāo)物要求：,82,內(nèi)標(biāo)法優(yōu)點：進(jìn)樣量不超量時，重復(fù)性及操作條件對結(jié)果無影響只需待測組分和內(nèi)標(biāo)物出峰，與其他組分是否出峰無關(guān) 適

36、合測定微量組分內(nèi)標(biāo)法缺點： 制樣要求高；找合適內(nèi)標(biāo)物困難；,83,（2）外標(biāo)法,方法：按要求配置對照品溶液CR和供試品溶液，CX分別進(jìn)樣，供試品記錄色譜圖。測定對照品的峰面積AR和供試品的峰面積AX（或峰高）。,前提：截距為0，對照品濃度與待測組分濃度接近,84,對照液（R）： AR CR,供試液（X）： AX CX,,CX CR,AX AR,——＝

37、——,,CX＝————,CR· AX,AR,要求：進(jìn)樣量準(zhǔn)確、操作條件穩(wěn)定,85,1）不需要校正因子，不需要所有組分出峰。 2）結(jié)果受進(jìn)樣量、進(jìn)樣重復(fù)性和操作條件影響大→每次進(jìn)樣量應(yīng)一致，否則產(chǎn)生誤差。,外標(biāo)法特點：,86,目的：,證明所采用的分析方法適合于相應(yīng)的檢測要求,,效能指標(biāo)：,評價分析方法的尺度,,效能指標(biāo)包括:,精密度, 準(zhǔn)確度, 檢測限,定量限,選擇性,線性與范圍, 耐用性,,第三節(jié) 藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗

38、證,87,指用該方法測定的結(jié)果與真實值接近的程度，表示分析方法測量的正確性。一般以回收率表示。,準(zhǔn)確度 (accuracy),（一）含量測定方法的準(zhǔn)確度 1.原料藥：可用已知純度對照品或供試品進(jìn)行測定；或與已知準(zhǔn)確度的另一方法測定的結(jié)果進(jìn)行比較,88,2.制劑：考察其他組分和輔料對回收率的影響,①用含已知量被測物的制劑各組分混合物（包括制劑輔料）進(jìn)行測定，回收率計算同原料藥,②向制劑中加入已知量的被測物進(jìn)行測定,③與已知準(zhǔn)確度的另一方

39、法測定的結(jié)果進(jìn)行比較,89,,例：取士的寧2.5mg，精密稱定加入到供試品中，按供試品溶液制備項下方法提取、測定，計算回收率。（在已知含量的樣品中加入精密稱定的對照品).,90,數(shù)據(jù)要求：,測定高、中、低三個濃度，n=3, 共9個數(shù)據(jù)來評價回收率；用UV和HPLC法時，一般回收率可達(dá)98%～102%；容量法可達(dá)99.7%～100.3%,91,在規(guī)定的測試條件下,同一個均勻樣品經(jīng)多次測定所得結(jié)果彼此符合程度。,精密度,（一）精密度表示

40、方法 1.偏差(deviation ,d) ；,d =測得值-平均值=Xi-X相對偏差（RD）＝d / X ×100％,92,2.標(biāo)準(zhǔn)偏差（standard deviation, SD或S）,3.相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard deviation, RSD),93,容量分析、重量分析法 ≤0.2% 紫外、原子吸收分析法 ≤ 1%HPLC、GC分析法 ≤ 2%TLC分析法 ≤ 2%,精密

41、度試驗結(jié)果的RSD允許數(shù)值:,94,方法的精密度以三種形式表達(dá). 1 重現(xiàn)性： 指在不同實驗室由不同分析者測定結(jié)果的精密度. (藥典分析方法的建立）2 中間精密度： 指同一實驗室,不同的時間由不同分析者或使用不同的儀器進(jìn)行測定的結(jié)果的精密度3 重復(fù)性： 在相同條件,由一個分析者測定所得結(jié)果的精密度.,95,精密度可分為,1.批內(nèi)精密度（日內(nèi)）：是同一次測得的精密度，考察方法在短時期內(nèi)的變異情況。,2

42、.批間精密度（日間）：是不同時間、不同批次測得的精密度?？疾旆治龇椒ㄔ诓煌瑫r間的變異情況。,,96,指在其他成分(如雜質(zhì)、降解產(chǎn)物、輔料等)可能存在下，采用的方法能準(zhǔn)確測定出被測物的特性。 鑒別、雜質(zhì)檢查、含量測定方法，均應(yīng)考察其專屬性。,專屬性,97,是指試樣中被測物能被檢測出的最低濃度或量，是限度檢驗指標(biāo)。它無需測定，只要指出高于或低于該規(guī)定的濃度或量即可。,檢測限 (limit of detection, LOD

43、),1.目視法：用含已知濃度被測物的試樣進(jìn)行分析，目視確定能被可靠地檢測出的被測物的最低濃度或量，常用于顯色鑒別法，TLC法； 2.信噪比法：當(dāng)用GC和HPLC法時，一般以S/N＝2或3時的相應(yīng)濃度來確定檢測限。,98,指樣品中被測物能被定量測定的最低量。是在保證一定可靠性（應(yīng)具有一定的準(zhǔn)確度和精密度）前提下，分析方法能夠測定出的樣品中藥物的最低濃度。,確定方法: 1 儀器分析： S/N=10 2 目視法

44、：,定量限(limit of quantitation ,LOQ),99,指利用一種方法取得精密度和準(zhǔn)確度均符合要求的試驗結(jié)果,而且成線性的供試物濃度的變化范圍。,線性,回歸方程的相關(guān)系數(shù)（r）越接近1，表明線性越好 可用一貯備液經(jīng)精密稀釋，或分別精密稱樣，制備一系列（至少5份）供試液進(jìn)行測定，以響應(yīng)值對濃度作圖，建立回歸方程，求出r如UV：制備一個標(biāo)準(zhǔn)系列，濃度點n =5 A=0.3-0.7 建立回歸

45、方程C = aA + b r ＞ 0.9999,100,是指達(dá)到一定精密度、準(zhǔn)確度和線性，測試方法適用的高低限度或量的區(qū)間。,原料藥和制劑含量測定：應(yīng)為測試濃度的80%～120%制劑含量均勻度檢查：應(yīng)為測試濃度的70%-～ 130%。 溶出度或釋放度中的溶出量測定：應(yīng)為限度的±20%。,范圍,101,目的： 為常規(guī)檢驗提供依據(jù)。,是指在測定條件有小的變動時，測定結(jié)果不受影響的承受程度。,耐用性 (robusness,

46、典型的變動因素有：被測溶液的穩(wěn)定性、樣品提取次數(shù)、時間等。HPLC變動因素有：流動相組成與pH，色譜柱，柱溫，流速等。GC變動因素有：色譜柱，固定相，擔(dān)體、柱溫、進(jìn)樣口和檢測器溫度等。,102,分析方法效能指標(biāo)的具體應(yīng)用：1.用于鑒別試驗：只要求專屬性、耐用性2.用于原料藥中雜質(zhì)測定和制劑中降解產(chǎn)物測定的方法： ①用于定量：除檢測限不要求外，其余指標(biāo)均要求。 ②限度檢查：只要求檢測限、專屬性、耐用性3. 原料、

47、制劑的含量測定及溶出度測定：不要求檢測限和定量限，其余均要求。,103,第四節(jié) 生物樣品分析方法的基本要求 一、常用樣品的種類、采集和貯藏 二、生物樣品分析前處理技術(shù) 三、定量分析方法驗證,104,一、常用樣品的種類、采集和貯藏,（一）血液測定藥物濃度指測定血漿或血清中的藥物濃度采集→制備血漿或血清貯藏：短期4℃、長期-20 ℃（二）唾液采集：自然分泌貯藏： 4℃以下,105,（三）尿液

48、 用于藥物劑量回收研究，尿清除率、生物利用度等的研究采集：自然排尿，時間尿，一定時間內(nèi)排泄的尿液全部儲存起來，記錄體積,106,二、生物樣品分析前處理技術(shù),存在形式多樣：游離型藥物、與蛋白質(zhì)結(jié)合型藥物、代謝物、葡萄糖醛酸苷、硫酸酯綴合物等成分復(fù)雜：蛋白質(zhì)、糖、脂肪、尿素、 Na+、K+、X-等,107,（一）去除蛋白質(zhì),目的:釋放結(jié)合型藥物減少提取過程中乳化保護(hù)儀器、提高靈敏度,方法:加入與水混溶的有機(jī)溶劑--

49、-使蛋白質(zhì)分子內(nèi)及分子間的氫鍵發(fā)生變化而使蛋白質(zhì)凝聚，與蛋白質(zhì)結(jié)合的藥物被釋放出來（甲醇、乙醇、乙腈、丙酮、四氫呋喃）。,108,加入中性鹽----如硫酸銨、硫酸鈉等，將與蛋白質(zhì)水合的水置換出來，使蛋白質(zhì)脫水而沉淀。,加入含鋅鹽、銅鹽的沉淀劑----在高于蛋白質(zhì)等電點的PH值時，與蛋白質(zhì)陰離子生成不溶鹽而沉淀。,加入強(qiáng)酸----10%的三氯乙酸，在低于蛋白質(zhì)等電點的PH值時，與蛋白質(zhì)陽離子生成不溶鹽而沉淀。,酶解法----蛋白質(zhì)水解酶，

50、使組織酶解，釋放出藥物，不發(fā)生乳化，對與蛋白質(zhì)結(jié)合牢固的藥物顯著提高回收率。,109,（二）綴合物的水解,酸水解酶水解：適用于遇酸不穩(wěn)定的藥物。常用葡萄糖醛酸苷酶、硫酸酯酶。,綴合物：藥物或代謝物與體內(nèi)的內(nèi)源性物質(zhì)結(jié)合生成的產(chǎn)物。,（三）有機(jī)破壞 測定生物樣品中的金屬離子，常用HNO3-HClO4作為消解劑，一般得到高價態(tài)金屬離子。,110,液-液萃取法（LLE）液-固萃取法（LSE） 相當(dāng)于縮小的柱色譜法濃集 末

51、次萃取液盡量少 揮去萃取溶劑,（四）分離、純化和濃集 使被測物在所用分析技術(shù)的檢測范圍內(nèi)，常用萃取法。,111,（五）化學(xué)衍生化,具有能被分離的性質(zhì) 提高靈敏度增強(qiáng)穩(wěn)定性提高對光學(xué)異構(gòu)體分離的能力,可使藥物：,112,2.固定相：載體+固定液（物理或機(jī)械涂漬法） 缺點：系統(tǒng)內(nèi)部壓力大，易流失，不實用 固定液—極性→NLLC 固定液—非極性→RLLC,液液分配色譜法（LLC）,

52、1.分離機(jī)制：利用組分在兩相中溶解度的差異,113,正相色譜:固定液極性 > 流動相極性（NLLC） 極性小的組分先出柱，極性大的組分后出柱, 適于分離極性組分,反相色譜:固定液極性 < 流動相極性（RLLC） 極性大的組分先出柱，極性小的組分后出柱, 適于分離非極性組分,3.分類,,114,將固定液機(jī)械地涂漬在擔(dān)體上組成固定相。缺點是液體固定相易流失。 70年代初發(fā)展了一種新型的固定相—化學(xué)鍵合固定相。

53、 這種固定相是通過化學(xué)反應(yīng)把各種不同的有機(jī)基團(tuán)鍵合到硅膠（載體）表面的游離羥基上，代替機(jī)械涂漬的液體固定相。,化學(xué)鍵合色譜,115,優(yōu)點: 1.避免了液體固定相流失 2.改善了固定相的功能，提高了分離的選擇性。,116,1．分離機(jī)制：分配 + 吸附（以LLC為基礎(chǔ)）2．特點： 1）不易流失 2）熱穩(wěn)定性好 3）化學(xué)性能好 4）載樣量大 5）適于梯度洗脫,117,反相鍵合相色譜,3.分類,（1）固定相：極性小的

54、烷基鍵合相 C8柱，C18柱（ODS柱),（2）流動相：極性大的甲醇-水或乙腈-水 流動相極性 > 固定相極性 例：水 + 甲醇，乙腈，THF,118,（4）出柱順序：極性大的組分先出柱,極性小的組分后出柱,（5）適用：非極性~中等極性組分（HPLC80%問題）,（3）流動相極性與k的關(guān)系： 流動相極性↑，洗脫能力↓，k↑，組分tR↑,119,（1）固定相：極性大的氰基或氨基鍵