激光掃描共聚焦顯微鏡系統(tǒng)及其在細胞生物學中的應用

1、激光掃描共聚焦顯微鏡系統(tǒng)及其在細胞生物學中的應用激光生物學報1998年6月第7卷第2期陳耀文1林玨龍1賴效瑩2梅品超1（1汕頭大學醫(yī)學院中心實驗室2物理單字與信息學教研室廣東汕頭515031）摘要激光掃描共聚焦顯微鏡是近十年發(fā)展起來的醫(yī)學圖象分析儀器，現(xiàn)已廣泛應用于熒光定量測量、共焦圖象分析、三維圖象重建、活細胞動力學參數(shù)監(jiān)測和胞間通訊研究等方面。其性能為普遍光學顯微鏡質(zhì)的飛躍，是電子顯微鏡的一個補充。本文以美國Meridian公司的A

2、CASULTIMA312為例簡要介紹了激光掃描共聚顯微鏡系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)，功能和生物學應用前景。關鍵詞關鍵詞激光；共聚焦顯微鏡；粘附細胞分析與篩選（ACAS）TheLaserScanningConfocalMicroscopyMicroscopySystemitsBiologicalApplicationsAhstractAhstractTheLaserScanningConfocalMicroscopyisanewmedicalimagea

3、nalysisinstrumentwhichisdevelopedinthelastdecade.Nowitiswidelyappliedinsuchfieldsasfluescentquantitativemeasurementconpocalimagelyusis3DreconstructionKiicsignalmonitiingoflivingcellcellcellcommunicationresearchesetc.Inth

4、ispaperACSAULTIMA312(MeridianCoUSA)istakenasanexampletointroducetheprincipleofconfocalmicroscopyitsfuionsbiologicalapplications.KeyKeywdswdsLaserConfocalMicroscopyAdherentCellAnalysissting(ACSA)激光掃描共聚焦顯微鏡（LaserscanningCo

5、nfocalMicroscopy，簡稱LSCM）是近代生物醫(yī)學圖象儀器的最重要發(fā)展之一，它是在熒光顯微鏡成象的基礎上加裝激光掃描裝置，使用紫外光或可見光激發(fā)熒光探針，利用計算機進行圖象處理，從而得到細胞或組織內(nèi)部微細結(jié)構(gòu)的熒光圖象，以及在亞細胞水平上觀察諸如Ca2、pH值、膜電位等生理信號及細胞形態(tài)的變化。已廣泛應用于細胞生物學、生理學、病理學、解剖學、胚胎學、免疫學和神經(jīng)生物學等領域[1、2、3]，對生物樣品進行定性、定量、定時和定位

6、研究具有很大的優(yōu)越性，為這些領域新一代強有力的研究工具。創(chuàng)建于1983年的美國Meridian公司，在90年代推出的“激光掃描共聚焦顯微鏡”這一項具有劃時代的義意的高科技產(chǎn)品，曾獲得美國“政府新產(chǎn)品獎”和兩次“高科技領先技術獎”，它能達到每秒120幅畫面的高速掃描激光共聚焦觀察，可提供實時，真彩色的激光共聚焦原色圖象。我院最近引起的ACASuLTIMA312是Meridian公司最新的高科技產(chǎn)品，為同類儀器中檔次最高、功能最全的精密儀器

7、?，F(xiàn)以該儀器為例介紹激光掃描共聚焦顯微鏡系統(tǒng)及其在細胞生物學中的應用。1、激光掃描共聚焦顯微鏡成像原理及組成有關共聚焦顯微鏡的某些技術原理，早在1957年就已提出，二十年后由Brengoff在高數(shù)值孔徑透鏡裝置上改裝成功具有高清晰度的共聚焦顯微鏡[5]，1985年WijnaendtsVanRest發(fā)表了第一篇有關激光掃描共聚焦顯微鏡在生物學中應用的文章，到了1987年，才發(fā)展成現(xiàn)在通常意義上的第一代激光掃描共聚焦顯微鏡。ACASULTI

8、Ma312系統(tǒng)采用獨特設計的軟件將激光細胞儀與先進的計算機技術結(jié)合，產(chǎn)生快速、高效、靈活的操作系統(tǒng)，完備的數(shù)據(jù)采集、分析與管理功能?；谏镝t(yī)學研究有如下的軟件。ImageAnalyze—對于單色、比色和三色標記的二維熒光圖像的定量分析，可產(chǎn)生透射光圖像重疊，同時AutoImage可多個區(qū)域的自動掃描和熒光定量，以及相同區(qū)域的時間順序掃描。RatioAnalysis和Kiics—測定細胞內(nèi)的離子變化，可有點掃描、線掃描及圖像掃描三種測定

9、形式，以監(jiān)測各種速率的生物反應。Cell–CellCommunicationFRAP相鄰細胞的FRAP分析。該軟件首先用可光淬滅特異的細胞熒光，然后在多個時間點掃描，此掃描可對單一區(qū)域或細胞的多個選擇區(qū)域，可產(chǎn)生透射光圖像并與其它圖像重疊。CellList—儲存被選擇細胞的位置，即可自動對較大樣品進行掃描，又可產(chǎn)生較小樣品特異部位的網(wǎng)絡位置表，以進行自動的測量、篩選和重復測定。CellSting—ACAS具備如下四種分選方式：Ablat

10、ionSt:預選定義一個熒光閾值，然后對特定細胞殺傷。②CookieCutterSt在用戶定義的中心點四周切割Cookies。③QuickSt：對已定義的細胞表列，用Ablation或CookieCutter作分選。④ManualSt：直接使用鼠標控制載物臺位置及激光脈沖，并殺滅和分選細胞，進行細胞顯微外科，染色體切割和光隱阱等操作。ConfocalImaging—共聚焦分析，可實現(xiàn)Z軸定量，三維立體圖像分析（包括SFP模擬熒光處理法，

11、DP深度投影法和SP文體投影法），以及視點移動動畫。3激光掃描共聚焦顯微鏡在細胞生物學中的應用3.1定量熒光測量ACAS可進行重復性極佳的低光探測及活細胞熒光定量分析。利用這一功能既可對單個細胞或細胞群的溶酶體，線粒體、DNA、RNA和受體分子含量、成份及分布進行定性及定量測定，還可測定諸如膜電位和配體結(jié)合等生化反應程度。此外，還適用于高靈敏度快速的免疫熒光測定，這種定量可以準確監(jiān)測抗原表達，細胞結(jié)合和殺傷及定量的形態(tài)學特性，以揭示諸如

12、腫瘤相關抗原表達的準確定位及定量信息。3.2定量共聚焦圖像分析借助于ACAS激光共焦系統(tǒng)，可以獲得生物樣品高反差、高分辨率、高靈敏度的二維圖像?？傻玫酵暾畹幕蚬潭ǖ募毎敖M織的系列及光切片，從而得到各層面的信息，三維重建后可以揭示亞細胞結(jié)構(gòu)的空間關系。能測定細胞光學切片的物理、生物化學特性的變化，如DNA含量、RNA含量、分子擴散、胞內(nèi)離子等，亦可以對這些動態(tài)變化進行準確的定性、定量、定時及定位分析。3.3三維重組分析生物結(jié)構(gòu)ACAS

13、使用SFP進行三維圖像重組，SFP將各光學切片的數(shù)據(jù)組合成一個真實的三維圖像，并可從任意角度觀察，也可以借助改變照明角度來突出其特征，產(chǎn)生更生動逼真的三維效果。3.4動態(tài)熒光測定Ca2、pH及其它細胞內(nèi)離子測定，利用ACAS能迅速對樣品的點，線或二維圖像掃描，測量單次、多次單色、雙發(fā)射和三發(fā)射光比率，使用諸如Indo1、BCECF、Fluo3等多種熒光探針對各種離子作定量分析?？梢灾苯拥玫酱蠓肿拥臄U散速率，能定量測定細胞溶液中Ca2對腫