高等真核生物細(xì)胞中監(jiān)測自噬試驗(yàn)方法的解釋與使用指南

1、高等真核生物細(xì)胞中監(jiān)測自噬試驗(yàn)方法的解釋與使用指南高等真核生物細(xì)胞中監(jiān)測自噬試驗(yàn)方法的解釋與使用指南摘要摘要目前有關(guān)細(xì)胞自噬的研究持續(xù)性地增加，不斷的吸引許多新的科學(xué)家進(jìn)入這一領(lǐng)域。因此，在不同的生物機(jī)體中建立一套標(biāo)準(zhǔn)的監(jiān)測巨自噬的準(zhǔn)則規(guī)定，就具有重要意義。最近的很多文獻(xiàn)已經(jīng)描述了已被使用于這一目的的檢測范圍。有許多有用并且簡便的方法可用于監(jiān)測酵母巨自噬，但在其他模型系統(tǒng)中相對較少；此外，用于測試高等真核生物的巨自噬，存在很多混淆的但看

2、似可接受的方法。需要強(qiáng)調(diào)的一個(gè)關(guān)鍵問題在于：在測量監(jiān)測的自噬體數(shù)目與測量那些流過自噬途徑的自噬體數(shù)目之間，存在一定的差異；這樣一來，巨自噬堆積，將導(dǎo)致自噬體的聚集作用，需要從完全功能性自嗜的分化作用，其包括輸送和降解，以及溶酶體（在大多數(shù)高等真核生物中）或液泡（在植物和真菌中）。本文中，我們提出一套指南，用于對這些方法的選擇和解釋，可供那些試圖檢測巨自噬及其相關(guān)進(jìn)程的研究人員使用，此外，那些需要對這些研究過程的文章提供實(shí)際與合理的批評意

3、見的審稿者也可以使用。本套指南并不意味著是一種公式化的規(guī)則，因?yàn)檫m當(dāng)?shù)臋z測方法部分地取決于那些所需要解決的問題和正在使用的系統(tǒng)。此外，我們強(qiáng)調(diào)，沒有任何的檢測方法能保證在各種情況下都是最恰當(dāng)?shù)?，我們?qiáng)烈推薦使用多種檢測方式來驗(yàn)證一種自噬反應(yīng)。關(guān)鍵詞關(guān)鍵詞自噬泡自噬體通量溶酶體吞噬泡壓力液泡在第一次自噬與健康和疾病的Keystone研討會(huì)上，一位坐在聽眾席的研究員在聽了若干細(xì)節(jié)上不充分的與記錄自噬相關(guān)的報(bào)告后，提出了這樣一個(gè)問題“證明自噬

4、的最關(guān)鍵的準(zhǔn)則是什么？”這是一個(gè)理性的問題，特別是考慮到我們每個(gè)人對這一問題都有可能有自己的見解。不幸的是，對于那些認(rèn)為自己可能找到了準(zhǔn)則的研究人員來說，這些準(zhǔn)則似乎是移動(dòng)著的目標(biāo)，他們悲哀的發(fā)現(xiàn)評論家們有著不同的觀點(diǎn)。相反，作為一個(gè)評論家，他們反復(fù)的提出相同的反對理由，疑惑為什么研究人員沒有達(dá)到證實(shí)自噬過程存在的基本要求。另外，潛在調(diào)控自噬的藥物越來越多的應(yīng)用到臨床診斷中，而且用于治療目的的可調(diào)控自噬的新藥屏障已經(jīng)建立起來。顯而易見的

5、，基于一套可被接受的準(zhǔn)則要求下，確認(rèn)這些藥物是否能夠真的影響自噬過程十分重要。因此，我們在此提出一套基本的指南，應(yīng)用這套指南，研究人員可以計(jì)劃和闡釋他們的實(shí)驗(yàn)，臨床醫(yī)生可以決定采用那種方法是最合適的，作者和評論員可以支持或批判某一研究成果。在為調(diào)控自噬選擇最合適的方法構(gòu)建指南的過程中，有幾個(gè)基本的要點(diǎn)需要謹(jǐn)記。十分重要的一點(diǎn)是對于監(jiān)測自噬所處的狀態(tài)沒有絕對的準(zhǔn)則適用于所有的情況。這是因?yàn)橛行z驗(yàn)方式是不適宜的，自身存在缺陷的，或者在特定

6、的細(xì)胞，組織或器官內(nèi)根本不起作用。另外，這些指南也許會(huì)作為新的方法論而演變發(fā)展，取代現(xiàn)有的檢測方法。雖然如此，建立一個(gè)可被接受的在多種實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)下均能可靠調(diào)控自噬的方法指南十分有用。需要注意的是，在這套指南里，“autophagy”通常代表巨自噬；其他自噬相關(guān)過程會(huì)在使用時(shí)特殊表明。一個(gè)基本的要點(diǎn)是自噬是一個(gè)動(dòng)態(tài)的多步驟過程，可以在許多步驟中積極的和消極的調(diào)控。從這點(diǎn)來看，自噬的途徑和其他代謝途徑不存在差別。例如，自噬體的積累（通過電子顯

7、微鏡圖像分析，GFPLC3熒光亮點(diǎn)分析，或者LC3脂化的western印記分析）可以反映出由于自噬活性的增加引起的自噬體形成的加快或者自噬體消亡的減慢（見圖1）。后吞噬泡（一種特殊的光滑，無核糖體的雙層膜）隔離開，吞噬泡成熟后成為前溶酶體自噬體是自噬的標(biāo)志。因此，在分析自噬過程中多種結(jié)構(gòu)的連續(xù)性變化時(shí)(吞噬泡、自噬體、amphisome和自噬泡)，使用電子顯微鏡是一種即有效又重要的定性和定量分析方法。從吞噬泡經(jīng)過自噬體的成熟是一個(gè)動(dòng)態(tài)和

8、連續(xù)過程，因而把這些結(jié)構(gòu)分類成為形態(tài)學(xué)上不相關(guān)聯(lián)的類別是存在問題的。幸運(yùn)的是，在大多數(shù)生理和病理情況下，檢測早期和晚期的自噬結(jié)構(gòu)產(chǎn)生足夠重要的數(shù)據(jù)來反映整個(gè)細(xì)胞中的自噬溶酶體所處的狀態(tài)。注意注意盡管電子顯微鏡是用于監(jiān)測自噬的最廣泛的方法之一，但是它同時(shí)也是最存在疑問的和易于誤解結(jié)果的方法之一。由于人工加工樣品的巨大潛力，謹(jǐn)慎選擇適宜的無偏差的量化方法和形態(tài)特征體視學(xué)分析十分重要。例如，計(jì)數(shù)自噬體的剖面是一種較好的辦法，然后只計(jì)數(shù)細(xì)胞的一

9、個(gè)區(qū)域內(nèi)是否存在自噬體，但是首選的方法用形態(tài)測量學(xué)立體測量學(xué)的方法確定自噬體體積占細(xì)胞質(zhì)體積的百分比。在量化過程中，確保取樣的隨機(jī)均等性什么重要，這意味著薄層區(qū)域內(nèi)每一個(gè)細(xì)胞具有相同的概率被計(jì)數(shù)?？煽康淖允审w鑒別方法是有效分析的前提。另外一個(gè)難點(diǎn)是，在哺乳動(dòng)物自噬體的成熟過程中包括一個(gè)從雙層膜結(jié)構(gòu)過渡到單層膜結(jié)構(gòu)的過程（如amphisomes和自噬泡）。因此，雙層膜在確定與自噬相關(guān)的結(jié)構(gòu)中不是必要的超微結(jié)構(gòu)證據(jù)，而且聘請專家來分析結(jié)果十

10、分重要，以避免誤解顯微照片。即使是在專家中，對真正的自噬體的特征仍有很大分歧。例如，饑餓誘導(dǎo)產(chǎn)生的自噬體應(yīng)包含細(xì)胞質(zhì)（即細(xì)胞質(zhì)和可能的細(xì)胞器），但自噬相關(guān)結(jié)構(gòu)涉及特定類型的自噬，如選擇性過氧化物酶，或線粒體的退化（分別為過氧化物酶體自噬或線粒體自噬）或有針對性的病原微生物的降解（xenophagy），可能相對缺乏細(xì)胞質(zhì)。此外，一些致病性微生物在感染過程中表達(dá)破壞膜結(jié)構(gòu)的因子，破壞自噬體正常的雙層膜結(jié)構(gòu)。我們甚至不清楚是該將特定細(xì)胞器降解

11、時(shí)產(chǎn)生的隔離結(jié)構(gòu)和xenophagy也定義為自噬體，還是應(yīng)該將其另外分別定義為過氧化物酶體自噬和xenophagosome，盡管它們的膜結(jié)構(gòu)和形成機(jī)制與饑餓誘導(dǎo)產(chǎn)生的自噬體相同。確定吞噬小體中原材料來源于自我吞食還是異源吞噬也十分困難；適當(dāng)?shù)臅r(shí)候，特殊的分析方法可以對吞噬原材料的來源進(jìn)行評估。無論如何，證明被膜隔離起來的區(qū)域里的物質(zhì)完全被降解十分必要。這是通過證明膜隔離結(jié)構(gòu)（線粒體或粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)潴泡）從完整到相繼瓦解直到完全消失的現(xiàn)象完成

12、的。在降解過程中仍保持不離散的事實(shí)說明吞噬小體在三維結(jié)構(gòu)上被膜包被。利用傳統(tǒng)的免疫細(xì)胞化學(xué)方法證明在融合后的細(xì)胞自噬體內(nèi)存在溶酶體酶也是可行的。最后，由于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的池狀結(jié)構(gòu)，包圍線粒體或其他細(xì)胞器的雙層膜結(jié)構(gòu)經(jīng)常能在剖面觀察到，這實(shí)際上與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)潴泡結(jié)構(gòu)出入橫剖平面有關(guān)。膜上存在的核糖體有助于我們區(qū)分出自噬體的無核糖體雙層膜結(jié)構(gòu)。在潛在不確定的情況下，需要使用免疫金標(biāo)簽電子顯微鏡，使用底物蛋白（細(xì)胞質(zhì)來源的；在這種情況下底物不能是大量存在的

13、細(xì)胞質(zhì)蛋白否則背景會(huì)很亮，細(xì)胞器標(biāo)記很適用）和LC3的抗體來證實(shí)自噬的結(jié)構(gòu)特性。這種方法的成功依賴于抗體的質(zhì)量，電子顯微鏡的準(zhǔn)備工作和樣品的固定化程序。應(yīng)用免疫電鏡時(shí)，作者要控制標(biāo)簽是獨(dú)特的，確保信號(hào)在背景下清晰可見。此外我們建議提供統(tǒng)計(jì)信息，因?yàn)橛斜匾@示一個(gè)選擇的多個(gè)部分。再次我們建議為定量數(shù)據(jù)首選適當(dāng)?shù)娜萘糠治龇椒?，而不僅僅是對選擇的區(qū)段進(jìn)行計(jì)數(shù)。我們必須牢記，即使是容量的形態(tài)測量學(xué)立體測量學(xué)分析只顯示穩(wěn)態(tài)水平，其本身不能為自噬通