解淀粉芽孢桿菌降解角蛋白機(jī)制的初步研究.pdf

1、角蛋白(keratin)屬于硬性蛋白，主要存在于動(dòng)物的表皮組織中，例如毛發(fā)，鱗片，羽毛，蹄，角等結(jié)構(gòu)中。具有抗化學(xué)試劑和水解酶攻擊的性質(zhì)。角蛋白因其難以降解的特性常被當(dāng)作農(nóng)工業(yè)副產(chǎn)物被丟棄，造成了很大的浪費(fèi)。角蛋白降解菌是一類(lèi)能夠直接利用角蛋白作為碳氮源的微生物，角蛋白降解菌能夠分泌多種角蛋白降解相關(guān)的酶類(lèi)，如角蛋白酶，蛋白酶以及二硫鍵還原酶，這些酶類(lèi)與菌體生長(zhǎng)所產(chǎn)生胞聯(lián)氧化還原系統(tǒng)一起作用于角蛋白，促使角蛋白變性，并使之降解。

2、　　本論文比較了10株解淀粉芽孢桿菌菌株的角蛋白降解能力及胞外蛋白分泌情況，發(fā)現(xiàn)Bacillus Amyloliquefaciens ACCC19735，可以在24h內(nèi)將羽毛完全降解。結(jié)合SDS-PAGE，LC-ESI-MS/MS的技術(shù)手段初步確定了13個(gè)角蛋白降解相關(guān)的酶類(lèi)，包括9個(gè)蛋白水解相關(guān)酶:4個(gè)S8家族的蛋白酶(proteinase)，2個(gè)M28家族的肽酶(peptidase)，1個(gè)M42家族的肽酶(peptidase)，1個(gè)

3、M32家族的羧肽酶(carboxypeptidase M32)，1個(gè)M17家族亮氨酰氨肽酶LAP(leucyl aminopeptidase);3個(gè)NADH代謝相關(guān)的酶:二氫硫辛酸脫氫酶DID(dihydrolipoyldehydrogenase)和NAD(P)H依賴(lài)型氧化還原酶NADO(NAD(P) H-dependent oxidoreductase);1個(gè)氨基酸代謝相關(guān)的酶:尿刊酸水合酶UHY(urocanate hydratas

4、e)。
　　通過(guò)全基因組測(cè)序獲得了該菌基因組精細(xì)圖，結(jié)合SDS-PAGE，LC-ESI-MS/MS技術(shù)以及生物信息學(xué)分析獲得了15個(gè)角蛋白降解相關(guān)基因序列，包括kerk, pam, pam1，pam2, mep, bap，bap2,bap3，serp，cap, lap, nado, did1，did2，uhy。其中kerk基因已被證明是角蛋白降解過(guò)程中的關(guān)鍵酶。其他多個(gè)基因均未有過(guò)角蛋白降解的相關(guān)研究。
　　本研究用大腸桿菌

5、誘導(dǎo)表達(dá)型載體pET28a構(gòu)建了pET28a-pam，pET28a-pam2兩個(gè)表達(dá)載體，并成功實(shí)現(xiàn)其在大腸桿菌中的表達(dá)，測(cè)定了這兩個(gè)氨肽酶的性質(zhì)，其中氨肽酶PAM與底物作用的最適溫度是45℃，最適pH是7.5，對(duì)leu-pNA的比活力為745U/mg，PAM2的最適作用溫度為50℃，最適pH為8.0，對(duì)Leu-pNA的比活為896U/mg，通過(guò)與解淀粉芽孢桿菌發(fā)酵液上清的協(xié)同實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證了這兩個(gè)蛋白在濃度為10uM的時(shí)候，對(duì)解淀粉芽孢桿