mtt配制、原理、操作步驟、結(jié)果分析、注意事項

1、MTT實驗操作步驟實驗操作步驟1.收集對數(shù)生長期細胞制成細胞懸液，細胞計數(shù)調(diào)整其濃度至5104ml。（MG63DOXSF86細胞都是這個濃度）。2.細胞懸液吹打均勻后，用排槍接種到96孔板，每孔100ul(即5000個細胞)。3.種完細胞后6—24小時后，等其完全貼壁，將排槍調(diào)至130ul，將上清液培養(yǎng)基吸出（吸取過程中要動作要輕，沿孔壁至每孔的左下角，槍尖不要在底面滑動，防止損傷細胞）。4.用完全培養(yǎng)基將藥物按梯度配制好，每孔加入含藥

2、培養(yǎng)基150ul，孵育72小時（每個藥物做3個復孔）。5.72h后，將排槍調(diào)至180ul，將上清液培養(yǎng)基吸出，每孔加入50ul0.5mgml的MTT溶液，孵箱內(nèi)孵育4小時。（MTT溶液配制方法：MTT粉末先用PBS緩沖液配制成5mgml，超聲溶解后過0.22ul微孔濾膜除菌，4℃保存，此為MTT母液，母液四度可保存一月，配制時注意不要配太多?。嶒炛蠱TT溶液為MTT母液10倍稀釋與不含血清培養(yǎng)基，e.g.如果需要10mlMTT溶液，取

3、1ml母液加9ml不含血清培養(yǎng)基）6.4h后，排槍調(diào)至80ul，將上清MTT溶液吸出（注意不要損失底面的紫色結(jié)晶），每孔加入150ulDMSO溶液，孵箱內(nèi)孵育1小時，以便結(jié)晶完全溶解。7.讀板器讀板（讀板前注意觀察紫色結(jié)晶是否完全溶解）8.讀板設置為570nm跟650nm兩波長讀數(shù)，輸出OD值為570nm處讀數(shù)650nm處讀數(shù)。e.g.cellplate:controlcontrol0.10.20.40.81.63.26.412.8ug

4、mlcontrolcontrolDRUG1controlcontrolcontrolcontrolcontrolcontrolDRUG2controlcontrolResult:0.07720.24760.24440.23940.19910.17840.16170.13760.10280.09660.08420.07750.07440.31080.29420.26830.23870.22390.18910.17370.12890.106

5、30.09660.07650.0760.31110.31850.28990.24720.21750.20480.16280.13670.11110.0940.07880.07240.31040.3190.27470.25130.22270.21440.16580.14390.11780.09380.07860.07850.31520.30390.28320.26110.23030.1930.16780.15060.10820.07970

6、.07540.07230.28830.3140.28640.25910.22830.20230.15650.1510.1230.09810.08080.07410.26440.29280.28480.27170.20650.18520.15660.14410.12040.08990.08340.0790.28460.26470.27430.22550.19530.17590.16440.14050.10830.08440.0832該溶解

7、液因含有SDS，在低溫保存的時候易產(chǎn)生結(jié)晶，因此在用之前必須提前幾小時拿至室溫，將SDS結(jié)晶全部溶解后再使用。五、五、MTTMTT法實驗步驟法實驗步驟1:胰酶消化對數(shù)期細胞，終止后離心收集，制成細胞懸液，細胞計數(shù)調(diào)整其濃度至5104ml。細胞數(shù)量因?qū)嶒災康牟煌瑧鱿鄳{(diào)整，如一般細胞增殖實驗每孔2000個就可以（相當于細胞懸液密度為2104ml），細胞毒性實驗每孔5000—10000個（相當于細胞懸液密度為5104ml）。此外，還應根據(jù)

8、細胞本身特性，如生長快慢，來決定細胞數(shù)量。比如：生長較快的細胞密度可略小。2將細胞懸液制備好后，輕輕吹打混勻，每孔加入100ul這樣待測細胞的密度為5000孔（邊緣孔用無菌PBS填充）。注意：因細胞在混勻后仍要繼續(xù)沉降，因此接種的過程中要反復多次混勻，如每加注意：因細胞在混勻后仍要繼續(xù)沉降，因此接種的過程中要反復多次混勻，如每加6個孔就混勻個孔就混勻一次，以確保接種的細胞密度在各孔之間完全相同，這對于一次，以確保接種的細胞密度在各孔之間

9、完全相同，這對于MTT的結(jié)果至關(guān)重要。的結(jié)果至關(guān)重要。3.將接種好的細胞培養(yǎng)板放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，至細胞單層鋪滿孔底（96孔平底板）加入濃度梯度的藥物原則上，細胞貼壁后即可加藥，或兩小時，或半天時間，但我們常在前一天下午鋪板，次日上午加藥.一般57個梯度每孔100ul設3個復孔，否則難以反應真實情況。對于加藥，有人直接將藥物按不同體積加入到96孔板中，以形成濃度梯度。但本人認為應盡量在EP管中將不同濃度的藥物配好管中將不同濃度的藥物配好，

10、然后將96孔板中的培養(yǎng)上清去掉（可以用排槍吸走）再加入100ul含不同濃度藥物的培養(yǎng)基，這樣能保證藥物濃度的準確。另外，需注意的是，如果用這種方法，不要把96孔板的培養(yǎng)液全部吸走后再加藥，應該吸完一部分后立即加樣，避免由于96孔板干燥引起細胞死亡。4.5%CO2，37℃孵育1648小時小時，倒置顯微鏡下觀察藥物的作用效果。下圖為一典型的藥物梯度為細胞的毒性作用。5.每孔加入10ulMTT溶液（5mgml，即0.5%MTT），繼續(xù)培養(yǎng)4h