醫(yī)學(xué)院開題報告

1、廣東醫(yī)學(xué)院2004級研究生,開題報告,Survivin與鼻咽癌放射殘存細(xì)胞 Tr-12放射抵抗的關(guān)系探討,研究生： 畢 宏 導(dǎo) 師： 孫 寧教授 時 間： 2005年8月20日,立題依據(jù),,立題依據(jù),放射治療是鼻咽癌的首選治療手段，但放射后5年生存率較低，局部復(fù)發(fā)和遠處轉(zhuǎn)移是放療失敗的原因。放射后存活細(xì)胞對放射的抵抗是放療后復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的基礎(chǔ)。明確放射抵抗的機理可提高放

2、療的局部控制率和完全緩解率。,立題依據(jù),研究證明腫瘤細(xì)胞對放射的反應(yīng)主要受基因控制 在受放射細(xì)胞中DNA鏈斷裂，伴有細(xì)胞周期、生長因子、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、基因表達的改變 照射存活后代放射抵抗機制可能與：凋亡減少;增殖減慢;DNA損傷修復(fù)能力增強有關(guān),survivin基因,Survivin是IAPs家族中分子量最小但抗凋亡能力最強而倍受關(guān)注的明星分子 位于染色體17q25，全長15kb，含4個外顯子，3個內(nèi)含子，編碼分子量為16.5

3、kD的蛋白質(zhì)羧基末端缺乏環(huán)指結(jié)構(gòu) ，氨基端只含有一個包含保守的Cys/His 的BIR功能區(qū),Survivin的組織分布,胚胎和胎兒組織中大量表達，分化成熟的正常組織無表達特異性地表達于多數(shù)腫瘤組織,survivin基因的主要功能,抑制凋亡Caspase途徑：caspase-3/7非caspase途徑：NFκB,survivin基因的主要功能,參與細(xì)胞周期調(diào)控 特異性地表達于G2/M期,survivin基因的主要功能,參與

4、血管的生成參與DNA損傷后修復(fù),,survivin參與腫瘤放療抵抗的機制,參與放射引起腫瘤細(xì)胞DNA損傷修復(fù)的調(diào)節(jié),survivin參與腫瘤放療抵抗的機制,阻滯細(xì)胞周期于放射不敏感期,survivin參與腫瘤放療抵抗的機制,阻止自發(fā)性和放射誘導(dǎo)性凋亡,以Survivin為靶點的腫瘤放射增敏,Survivin核酶 Pennati等用靶向Survivin的錘頭狀核酶作用于兩個過表達Survivin的黑色素瘤細(xì)胞株 ，γ-射線照射后

5、，與親代細(xì)胞相比，表達核酶的細(xì)胞克隆形成率下降，caspase-3活性提高，凋亡水平增加,以Survivin為靶點的腫瘤放射增敏,Survivin反義寡核苷酸 Cao等在肺癌小鼠模型中，瞬時轉(zhuǎn)染survivin與XIAP的反義寡核苷酸能顯著下調(diào)它們的表達，反義治療聯(lián)合放療組的移植瘤出現(xiàn)了超過15天的生長延遲,以Survivin為靶點的腫瘤放射增敏,siRNA干擾 Kappler等以survivin siRNA轉(zhuǎn)染肉瘤細(xì)胞，發(fā)

6、現(xiàn)survivin表達明顯下降，且腫瘤細(xì)胞的放射敏感性隨照射劑量的增加而增加。,姜黃素放射增敏的研究進展,姜科姜黃屬植物姜黃Curcuma longa L．(C．domestica Valet．)是一種常用中藥，藥用其根莖 抗炎抗氧化抗凝降血脂 抗動脈粥樣硬化及抗腫瘤,姜黃素放射增敏的研究進展,我室黃小軍、曹璋的實驗已證明姜黃素通過改變細(xì)胞周期對鼻咽癌放射抵抗細(xì)胞的增敏作用,創(chuàng)新之處,探討survivin與鼻咽癌細(xì)胞放射抵抗的關(guān)系以

7、及姜黃素對survivin表達的影響，為鼻咽癌的放射增敏提供理論依據(jù),研究目標(biāo),,研究目標(biāo),探討survivin的表達與鼻咽癌細(xì)胞放射抵抗的關(guān)系，姜黃素作用對survivin表達及放射敏感性的影響，為鼻咽癌預(yù)后的判斷，放療后復(fù)發(fā)的治療及放射增敏提供理論指導(dǎo),研究目標(biāo),對比慢性鼻咽炎、鼻咽低分化鱗狀細(xì)胞癌及放療后復(fù)發(fā)鼻咽癌survivin及caspase-3蛋白表達，,研究內(nèi)容,,研究內(nèi)容,CNE-2Z及其放射殘存細(xì)胞tr12的培養(yǎng)。分

8、別檢測兩個細(xì)胞株的自發(fā)凋亡水平，然后施以不同劑量(暫定為2、4、8、10Gy)的照射，培養(yǎng)一定時間后用hoechst33342/PI雙染法檢測凋亡水平；RT-PCR檢測survivin的mRNA水平；比色法測caspase-3的活性變化,研究內(nèi)容,收集慢性鼻咽炎、鼻咽低分化鱗狀細(xì)胞癌、放射后復(fù)發(fā)的鼻咽癌標(biāo)本各20例，用MSP法測fhit基因甲基化是否存在及甲基化率，用免疫組織化學(xué)法測PKC的表達。,研究內(nèi)容,對Tr-12細(xì)胞做姜黃素的細(xì)

9、胞毒實驗（MTT法），取低毒性劑量聯(lián)合照射（不同劑量）作用于Tr-12細(xì)胞，設(shè)對照組、單純加藥組、藥物聯(lián)合放射組、單純放射組。各組細(xì)胞用克隆形成實驗繪制放射-存活曲線；RT-PCR檢測survivin的mRNA水平，免疫細(xì)胞化學(xué)檢測survivin和caspase-3的表達,研究內(nèi)容,收集慢性鼻咽炎、鼻咽分化性非角化型鱗狀細(xì)胞癌、放射后復(fù)發(fā)的鼻咽癌標(biāo)本各30例，免疫組化檢測survivin與caspase-3蛋白的表達,技術(shù)路線,,一、

10、實驗病理部分,CNE-2Z細(xì)胞培養(yǎng),Tr-12細(xì)胞培養(yǎng),姜黃素細(xì)胞毒實驗(MTT),不同劑量照射,空白對照組,空白對照組,不同劑量照射,姜黃素加照射,,姜黃素閾下劑量,克隆形成實驗,RT-PCR測survivin ,caspase-3mRNA水平比色法測caspase-3活性hoechst/PI雙染測凋亡水平免疫細(xì)胞化學(xué)測survivin caspase-3蛋白表達,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,二、臨床病理部分,慢性鼻

11、咽炎,鼻咽分化性非角化型鱗狀細(xì)胞癌,放療后復(fù)發(fā)鼻咽癌,,,,,,,Survivin蛋白表達 免疫組化,Caspase-3蛋白表達免疫組化,,,,擬解決的關(guān)鍵問題,CNE-2Z及其放射殘存細(xì)胞tr-12的培養(yǎng)。放射后復(fù)發(fā)的鼻咽癌標(biāo)本的收集。,預(yù)期結(jié)果,,預(yù)期結(jié)果,照射前和不同劑量照射后Tr-12細(xì)胞株中survivin的表達明顯高于CNE-2Z；caspase-3的活性在CNE-2Z中比Tr-12中高；hoechst/PI雙染法測

12、凋亡水平在CNE-2Z中高于Tr-12,預(yù)期結(jié)果,姜黃素一定濃度作用于Tr-12后，survivin的表達低于作用前，照射與姜黃素聯(lián)合組比單純照射組的存活分?jǐn)?shù)低，免疫細(xì)化顯示survivin的表達也比單純照射組低。慢性鼻咽炎中survivin表達幾乎為零，鼻咽低分化鱗癌中survivin表達水平低于放療后復(fù)發(fā)的鼻咽癌，caspase-3的表達與survivin呈反相關(guān)。,經(jīng)費預(yù)算,細(xì)胞培養(yǎng)基本材料及放射費 2000元 casp

13、ase-3活性檢測 2000元免疫組化試劑 2000元 hoechst/PI雙染 3000元 姜黃素 1000元,進度安排,2006年3月至2006年5月培養(yǎng)細(xì)胞，免疫組化預(yù)實驗及石蠟標(biāo)本中survivin、caspase-3表達的檢測。2006年6月至2006年