藥典常用定量分析方法概述

1、,鹽城衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院,第四章 藥典中常用定量分析方法概述Chapter 4 Assay,藥物分析技術(shù)Technology of Pharmaceutical Analysis,學(xué)習(xí)目標(biāo),在回顧總結(jié)常見定量分析方法的基礎(chǔ)上，介紹了常見定量分析方法在《中國藥典》現(xiàn)行版中的應(yīng)用，通過本章的學(xué)習(xí)，為理解好掌握后面藥物的含量測定打下堅實基礎(chǔ)。,重量分析法 酸堿滴定(非水酸堿滴定法)

2、 配位滴定 容量分析法 沉淀滴定 分 氧化還原滴定 紙色譜PC 析 電化學(xué)分析法 平面色譜 化 經(jīng)典色譜 薄層色譜TL

3、C 學(xué) ☆色譜分析 柱色譜法(CC) 氣相色譜法(GC) 現(xiàn)代色譜 *高效液相色譜法(HPLC)

4、 高效毛細(xì)管電泳法(HPCE) 紫外—可見分光光度法(UV—Vis) 紅外分光光度法IR 原子吸收分光光度法(AAS) 光

5、譜分析 原子發(fā)射分光光度法(AES) 或波譜分析 熒光分析法(Fluor) 核磁共振法(NMR) 質(zhì)譜法(MS),,,,,,,,電導(dǎo)法,電位法,伏安法,電化學(xué)分析法,電解法,極譜法,,續(xù)前,按任務(wù)分 定性分析 定量分析 結(jié)構(gòu)分析,：鑒定組成

6、：測定含量：研究結(jié)構(gòu),按對象分 無機(jī)分析有機(jī)分析,：鑒定組成和測定含量：官能團(tuán)的分析和結(jié)構(gòu)鑒定,按測定原理分 　化學(xué)分析　儀器分析,：重量分析，滴定分析?。汗鈱W(xué)分析，電分析，色譜分析 NMR，MS，電子顯微鏡，x-射線分析,知識要求,掌握常見定量分析方法的基本原理，在藥物分析中的測定方法及分析結(jié)果的計算。熟悉常見定量分析方法在使用中的注意事項。了解其他定量分析方法及高效液相色譜儀、紫外-可見分光光度計等儀器的結(jié)

7、構(gòu)。,能力要求,熟練應(yīng)用常見定量分析技術(shù)對藥物進(jìn)行定量分析。學(xué)會使用定量分析儀器并能對分析數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。,Ch4-1 化學(xué)分析法,重量分析法酸堿滴定法氧化還原滴定法非水溶液滴定法沉淀滴定法配位滴定法,Ch4-1-1 重量分析法,通過稱量被測組分的質(zhì)量來確定被測組分百分含量的分析方法,分類： 揮發(fā)法 萃取法 沉淀法,特點(diǎn)： 準(zhǔn)確度高， 費(fèi)時，繁瑣， 不適合

8、微量組分,Ch4-1-2 酸堿滴定法,容量分析法（滴定分析法）：將一種已知準(zhǔn)確濃度溶液（滴定液）滴加到待測物質(zhì)的溶液中，直到化學(xué)反應(yīng)按計量關(guān)系完全作用為止，然后根據(jù)所用滴定液的濃度和體積計算出待測物質(zhì)含量的一種分析方法。酸堿滴定法（中和法）：以酸、堿中和反應(yīng)為基礎(chǔ)的滴定分析法。以酸（堿）性滴定液滴定到被測物質(zhì)，以酸堿指示液或儀器指示終點(diǎn)，根據(jù)酸（堿）滴定液的濃度好消耗的體積，計算出被測物質(zhì)的含量。,,酸堿的定義,電離理論電子理

9、論質(zhì)子理論,應(yīng)用,直接滴定法： Ca ?Ka1≥ 10-8 的弱酸 Cb ?Kb1≥ 10-8 的弱堿剩余滴定法,非水溶液滴定法non-aqueous titration method,非水溶液酸堿滴定法是以非水溶劑作為滴定介質(zhì)，不僅可增大有機(jī)物的溶解度，還可改變?nèi)芤旱乃釅A性，克服在水溶液中滴定的困難，從而擴(kuò)大酸堿滴定的應(yīng)用范圍。,酸堿滴定一般是在水溶液中進(jìn)行，以水為溶劑既價

10、廉又安全，但是也會受到一定的局限性。如: ①弱酸或弱堿在水溶液中沒有明顯的滴定突躍； ②有機(jī)酸或堿在水中溶解度較??； ③還有一些多元酸或多元堿，混合酸（堿），由于它們的離解常數(shù)較接近，在水中不能分步或分別滴定。,（1）非水酸量法non-aqueous acidimetry 滴定液：甲醇鈉的苯-甲醇溶液。 指示劑：鄰硝基苯胺。 溶劑：二甲基甲酰胺。（2）非水堿量法non-a

11、queous alkalimetry 滴定液：高氯酸二氧六環(huán)溶液 指示劑：甲基紅 結(jié)晶紫 溶劑：冰醋酸 醋酐,Ch4-1-3 氧化還原滴定法,以氧化還原反應(yīng)為基礎(chǔ)的滴定分析方法。,實質(zhì)：電子的轉(zhuǎn)移特點(diǎn)： 1）機(jī)理復(fù)雜、多步反應(yīng) 2）有的程度雖高但速度緩慢 3）有的伴有副反應(yīng)而無明確計量關(guān)系分類： 碘量法、高錳酸鉀法、重鉻酸鉀法、 亞硝酸鈉法

12、、溴量法、鈰量法 應(yīng)用：廣泛，直接或間接測定無機(jī)物、有機(jī)物,（一）碘量法***,利用I2的氧化性和I-的還原性建立的滴定分析方法,注：pH < 9 時，不受酸度影響，應(yīng)用范圍更為廣泛,電對反應(yīng) I2 + 2e 2I-,I2 + I - I3- （助溶）,I3- + 2e 3 I-,（一）直接碘量法: 利用

13、I2的弱氧化性質(zhì)滴定還原物質(zhì),測定物：具有還原性物質(zhì),可測：S2-，Sn(Ⅱ)，S2O32-，SO32-酸度要求：弱酸性，中性，或弱堿性(pH小于9)強(qiáng)酸性介質(zhì)：I-發(fā)生氧化導(dǎo)致終點(diǎn)拖后； 淀粉水解成糊精導(dǎo)致終點(diǎn)不敏銳 強(qiáng)堿性介質(zhì)：I2發(fā)生歧化反應(yīng),3I2 + 6OH- 5I- + IO3- + 3H2O（歧化反應(yīng)）,4I-+O2 + 4H+

14、 2I2 + 2H2O（氧化反應(yīng)）,（二）間接碘量法： 利用I-的中等強(qiáng)度還原性滴定氧化性物質(zhì),測定物：具有氧化性物質(zhì),可測：MnO4-，Cr2O7-，CrO4-，AsO43-，BrO3-， IO3-，H2O2，CLO-，Cu2+酸度要求：中性或弱酸性強(qiáng)酸性介質(zhì)：S2O32-發(fā)生分解導(dǎo)致終點(diǎn)提前；

15、I-發(fā)生氧化導(dǎo)致終點(diǎn)拖后堿性介質(zhì)： I-與S2O32-發(fā)生副反應(yīng)，無計量關(guān)系,S2O32- + 2H+ SO2 ↑+ S↓+ H2O（分解）,4 I2 + S2O32- + 10 OH- 8I- + 2SO42-+5H2O,（三）碘量法誤差的主要來源,1．碘的揮發(fā)預(yù)防： 1）過量加入KI——助溶，防止揮發(fā)

16、 增大濃度，提高速度2）溶液溫度勿高3）碘量瓶中進(jìn)行反應(yīng)（磨口塞，封水）4）滴定中勿過分振搖,2．碘離子的氧化（酸性條件下）預(yù)防：1）控制溶液酸度（勿高）2）避免光照（暗處放置）3）I2完全析出后立即滴定4）除去催化性雜質(zhì)（NO3-，NO，Cu2+）,（四）標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制與標(biāo)定,1．NaS2O3溶液,A．配制：不穩(wěn)定原因 a．水中溶解的CO2易使NaS2O3分解 S2O32- + CO2 + H

17、2O → HSO3- + HCO3-+ S↓ b．空氣氧化：2S2O32-+ O2 →SO42- + S↓ c．水中微生物作用： S2O32- →Na2SO3 + S↓配制方法：煮沸冷卻水，加入NaCO3使 pH=9~10， 放置7~8天，過濾,B．標(biāo)定,續(xù)前,Cr2O72-+ 6I- （過量）+ 14H+ 2Cr3++ 3I2 + 7H2O

18、（酸度高） I2 + 2S2O32- 2I-+ S4O62- （加水稀釋→弱酸性）,I2 + 2S2O32- 2I-+ S4O62- （加水稀釋→弱酸性）,K2CrO7基準(zhǔn)物標(biāo)定法 I2標(biāo)液比較法,續(xù)前,2．碘標(biāo)準(zhǔn)溶液,A．配制: 避光，防止I-→I2（注：不可用分析天平稱）B．標(biāo)定：As2

19、O3基準(zhǔn)物質(zhì)標(biāo)定法NaS2O3標(biāo)準(zhǔn)溶液比較法,As2O3 + 6OH - 2AsO33- + 3H2OAsO33- + I2 + 2H2O H3AsO4 + 2 I - + H+,（五）淀粉指示劑,要求：室溫；弱酸性；新鮮配制 加入時間： 直接碘量法——滴定前加入（終點(diǎn)：無色→深藍(lán)色） 間接碘量法——近終點(diǎn)加入（終點(diǎn)：深藍(lán)色消失）變色原理

20、：,注：間接碘量法中淀粉指示劑過早加入，強(qiáng)烈吸附I2， 造成終點(diǎn)拖后,I2（過量）+ I- I3- （與淀粉形成深藍(lán)色配合物）,（六）應(yīng)用與示例,1．直接碘量法：指示劑加入時間：滴定前加入終點(diǎn)：無色→深藍(lán)色例：Vc的測定,2．間接碘量法指示劑加入時間：近終點(diǎn)加入終點(diǎn)：深藍(lán)色消失1）剩余碘量法(返滴定法)例：葡萄糖的測定2）置換

21、碘量法例：CuSO4的含量測定,剩余碘量法測葡萄糖的含量,注：無須知道CI2,,葡萄糖 + I2（定過量） 葡萄糖酸鹽 I2（剩余）+ 2Na2S2O3 2 NaI + Na2S4O6,置換碘量法測定CuSO4的含量,注：CuI易水解，故以HAc為介質(zhì)CuI強(qiáng)烈吸附I2造成終點(diǎn)提前，滴定時應(yīng)用力振搖 或加入KSCN轉(zhuǎn)化CuI沉淀為CuSCN，同時釋放I2,2Cu2+

22、 + 4I- （過量） 2CuI ↓ + I2 I2 + 2S2O32- 2I- + S4O62-,Ch4-1-5 沉淀滴定法,通過本章的學(xué)習(xí)，能熟練運(yùn)用鉻酸鉀指示劑法、鐵銨礬指示劑法、吸附指示劑法和電位滴定法的原理測定難溶性銀鹽化合物的含量。這為后期進(jìn)行藥物分析課程的學(xué)習(xí)奠定基礎(chǔ)。,吸附指示劑法（Fayans法，法揚(yáng)司法 ）,吸附指示劑法：利

23、用沉淀對有機(jī)染料吸附而改變顏色 來指示終點(diǎn)的方法吸附指示劑：一種有色有機(jī)染料，被帶電沉淀膠粒吸 附時因結(jié)構(gòu)改變而導(dǎo)致顏色變化,原理：,SP前： HFL H+ + FL- （黃綠色） AgCL:CL- - - - - 吸附過量CL-SP時：大量AgCL:Ag+::FL-（淡紅色）- - --雙電層吸附,滴定條件及注意事項

24、 a）控制溶液酸度，保證HFL充分解離：pH＞pKa 例：熒光黃pKa 7.0——選pH 7~10 曙紅pKa2.0—— 選pH ＞2 二氯熒光黃pKa 4.0——選pH 4~10 b）防止沉淀凝聚 措施——加入糊精，保護(hù)膠體 c）鹵化銀膠體對指示劑的吸附能力 < 對被測離子的吸附能力( 反之終點(diǎn)提

25、前 ，差別過大終點(diǎn)拖后) 吸附順序：I-＞SCN-＞Br -＞曙紅＞CL-＞熒光黃 例： 測CL－→熒光黃 測Br－→曙紅,,D．避免陽光直射E．被測物濃度應(yīng)足夠大F．被測陰離子→陽離子指示劑 被測陽離子→陰離子指示劑,適用范圍： 可直接測定CL-，Br-，I-，SCN-和Ag +,電位滴定法,原理：是一種容量分析中確定終點(diǎn)或選擇、

26、核對指示劑變色域的方法。 應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定待測物溶液過程中,借助指示電極﹑參比電極和電位計來監(jiān)測滴定時電極電位的變化率, 發(fā)生“突躍”的最大點(diǎn)就是滴定的終點(diǎn),以替代一般指示劑用變色來指示終點(diǎn)的方法。,應(yīng)用,酸堿滴定法：PH—V（含非水）沉淀滴定法：PAg—V 絡(luò)合滴定法：PM—V氧化還原滴定法：E—V,,,2.終點(diǎn)指示方法,◆學(xué)習(xí)目的,Ch4-1-6 配位滴定法,學(xué)習(xí)目標(biāo)知識目標(biāo) 掌握

27、EDTA的性質(zhì)和與金屬離子配位反應(yīng)的特點(diǎn)；金屬指示劑的變色原理、具備條件和常用金屬指示劑；EDTA滴定液的配制和標(biāo)定。 熟悉影響配位反應(yīng)平衡的因素；配位滴定酸度條件的選擇及配位滴定法在藥物分析中的應(yīng)用。 了解副反應(yīng)和副反應(yīng)系數(shù)及條件穩(wěn)定常數(shù)的意義。能力目標(biāo) 熟練應(yīng)用掌握EDTA滴定液的配制、標(biāo)定和直接測定金屬離子的含量的操作技能和計算。 學(xué)會用返滴定法測定鋁鹽的操作技術(shù)和計算。,,,,氮測定法,

28、＊凱氏定氮法－藥物分析 杜馬氏法－元素定量分析 范斯萊克法－生化分析 （氨基氮測定）,1、原理 含氮供試品與濃硫酸共熱，供試品中所含氮轉(zhuǎn)變成氨，并與硫酸結(jié)合為硫酸氫銨和硫酸銨，用氫氧化鈉堿化后，釋出氨，隨水蒸氣餾出，用硼酸溶液或定量的酸吸收后，用標(biāo)準(zhǔn)酸液或標(biāo)準(zhǔn)堿液滴定，用空白試驗校正。,,,凱氏定氮法分為3個步驟,(1) 消解 (凱氏燒瓶中進(jìn)行)

29、 將樣品、Con.H2SO4、K2SO4、CuSO4放入凱氏燒瓶中一起加熱，有機(jī)含N化合物中的N全部轉(zhuǎn)變成NH3并以銨鹽的形式固定－(NH4)2SO4、NH4HSO4。,H2SO4：氧化劑和炭化劑。 SO2和SO3 消解一般在通風(fēng)櫥中進(jìn)行,K2SO4：提高H2SO4沸點(diǎn) 縮短消解時間,CuSO4：催化劑，使消解速度加快,消解產(chǎn)物：(

30、NH4)2SO4、NH4HSO4,,,(2) 蒸餾與吸收,用40%的NaOH溶液水蒸氣蒸餾,(NH4)2SO4+2NaOH?Na2SO4+2NH3?+2H2ONH4HSO4+NaOH?NaHSO4+NH3?+H2O,,,(3) 測定,①   直接滴定法,吸收液：2%硼酸溶液滴定液：0.005mol/L H2SO4液每1ml的0.005mol/L H2SO4液=0.1401mg的N指示劑：甲基紅-溴甲酚綠混

31、合指示劑終點(diǎn)顏色：灰紫色NH3+H3BO3?NH3.H3BO32NH3.H3BO3+H2SO4?(NH4)2SO4+2H3BO3,,,②   剩余滴定法,用標(biāo)準(zhǔn)鹽酸或硫酸作吸收液。將蒸餾出來的NH3吸收于定過量的標(biāo)準(zhǔn)酸溶液中，過量的酸用標(biāo)準(zhǔn)堿溶液滴定。,,,永停滴定法,1. 原 理,測量時, 把兩個相同的鉑電極插入滴定溶液中,在兩個電極間外加小電壓（10-200mv）, 進(jìn)行滴定，根據(jù)電流變化情況確定

32、終點(diǎn)。,,,①可逆電對：I2/I－ 兩個鉑電極間外加一個小電壓, 接正端的電極發(fā)生氧化反應(yīng)：2I－≒I2＋2e,接負(fù)端的電極發(fā)生還原反應(yīng)：I2＋2e≒2I－ ,即發(fā)生電解。 只有兩個電極上都發(fā)生反應(yīng),他們之間才會有電流通過。 I2/ I－,在溶液中與雙鉑電極組成電池 ,給一個很小的外加電壓就能產(chǎn)生電解,有電流通過,稱為可逆電對。,⑴可逆電對與不可逆電對,電對的氧化態(tài)和還原態(tài)濃度相等時電流最大;不相等時電流的大小決

33、定于濃度低的那個氧化態(tài)和還原態(tài)的濃度。,,,②不可逆電對：S4O62－與S2O32－(S4O62－/ S2O32－),,,三 永停滴定法,永停滴定法: 利用上述現(xiàn)象確定滴定終點(diǎn)的方法。,2. 指示終點(diǎn)的方法,①滴定劑屬可逆電對,被測物屬不可逆電對 如：I2滴定Na2S2O3,終點(diǎn)前：a.溶液中只有S4O62－/ S2O32－電對,雖有外加電壓, 也不能產(chǎn)生電解。b.溶液中雖有I－,陽極上有I－氧化成I2的可能性, 無I2 ,故

34、電解反應(yīng)同樣不能發(fā)生。所以,終點(diǎn)前電流計指針一直在0電流位置上不動。,,,,第二節(jié) 藥典常用分析方法,三 永停滴定法,終點(diǎn)時：達(dá)到終點(diǎn)有稍過量的I2,溶液中有I2/ I－可逆電對,電極上產(chǎn)生電解反應(yīng),有電流通過,電流計指針開始偏轉(zhuǎn)并不再返回0,指示滴定終點(diǎn)到達(dá)。,終點(diǎn)后：隨I2濃度的逐漸增加,電解濃度逐漸增大。,,,②滴定劑為不可逆電對,被測物為可逆電對如Na2S2O3滴定I2,終點(diǎn)前：即存在I2/ I－的可逆電對,有電流通過,滴定越

35、接近終點(diǎn),I2的濃度逐漸變小, 電流逐漸變小。,終點(diǎn)時：由于I2濃度為0, 電解電流變?yōu)?,指針突然下降并停留在0電流的位置保持不動,指示滴定終點(diǎn)到達(dá)。,終點(diǎn)后：溶液中只有S4O62－/ S2O32－的不可逆電對,無電解發(fā)生,電流降到最低點(diǎn)并不在變化,,,③滴定劑與被滴定劑均為可逆電對 如Ce4＋滴定Fe2＋,滴定前：溶液中只有Fe2＋, 無Fe3＋存在,陰極上不可能有還原反應(yīng), 無電解反應(yīng),無電流通過。,滴定時：當(dāng)Ce4＋↑→Fe

36、3＋↑ ∵Fe3＋/ Fe2＋可逆 ∴電流不斷↑; 當(dāng)【Fe3＋】=【Fe2＋】時,電流達(dá)到最大值, 繼續(xù)加入Ce4＋ , 【Fe2＋】↓ ,電流↓。,終點(diǎn)時：電流降至最低點(diǎn)。 陽極【O】：Fe2＋≒Fe3＋＋e 陰極【H】：Fe3＋＋e≒Fe2＋,,,,第二節(jié) 藥典常用分析方法,三 永停滴定法,終點(diǎn)后：Ce4＋過量，溶液中有Ce4＋/

37、 Ce2＋可逆電對，【Ce4＋】不斷 ↑ ∴電流又開始上升。 陽極【O】：Ce2＋≒Ce4＋＋2e 陰極【H】：Ce4＋＋2e≒Ce2＋,,,,第二節(jié) 藥典常用分析方法,三 永停滴定法,3. 應(yīng) 用,(1)重氮化滴定法的終點(diǎn)指示,(2)在用Karl Fisher法測定微量水 分時的終點(diǎn)指示（自習(xí)）,二、光學(xué)分析法及其分類,（一）光學(xué)分析法 依據(jù)物質(zhì)發(fā)射

38、的電磁輻射或物質(zhì)與電磁輻射相互 作用而建立起來的各種分析法的統(tǒng)稱~。,（二）分類： 1．光譜法：利用物質(zhì)與電磁輻射作用時，物質(zhì)內(nèi)部 發(fā)生量子化能級躍遷而產(chǎn)生的吸收、發(fā)射或散射 輻射等電磁輻射的強(qiáng)度隨波長變化的定性、定量 分析方法,2．非光譜法：利用物質(zhì)與電磁輻射的相互作用測定 電磁輻射的反射、折射、干涉、衍射和偏振等基

39、 本性質(zhì)變化的分析方法 分類：折射法、旋光法、比濁法、χ射線衍射法,3．光譜法與非光譜法的區(qū)別：,Ch4-2 紫外-可見分光光度法,紫外-可見吸收光譜（Ultraviolet and Visible Spectroscopy, UV-VIS）統(tǒng)稱為電子光譜。 紫外-可見吸收光譜法是利用某些物質(zhì)的分子吸收200～800nm光譜區(qū)的輻射來進(jìn)行分析測定的方法。這種分子吸收光譜產(chǎn)生于價電子和分子軌道上的電子在電子能級

40、間的躍遷，廣泛用于有機(jī)和無機(jī)物質(zhì)的定性和定量測定。,⑴原理：根據(jù)Lambert—Beer定律 A = E CLE：吸收系數(shù) C:單位濃度 L:液層厚度,吸收系數(shù)有兩種：,①摩爾吸收系數(shù)（ε）：指在一定波長下,溶液濃度為1mol/L厚度為1㎝時的吸收度.,②百分吸收系數(shù)（ ）：指在一定波長下,溶液濃度為1%（W/V）厚度為1㎝的吸收度.,③ε與E關(guān)系E= 吸收物質(zhì)的摩爾質(zhì)量（分子量）強(qiáng)吸收度：

41、ε=104~105 弱吸收度：ε<102中強(qiáng)吸收：ε=102~104,,,(2) 應(yīng) 用,①定性鑒別：,λmax及ε或E Aλmax /Aλmin 與標(biāo)準(zhǔn)品溶液的吸收光譜比較,② 純度檢查：,在某波長，藥物無吸收，而所含雜質(zhì)有吸收，可檢查某雜質(zhì)的限度。,,,如：腎上腺素中腎上腺酮的檢查,腎上腺素 2mg/mL 的0.05mol/L HCl液,310nm處測得的A≯0.05,腎上腺銅的E

42、=435 ,求其限量,,,,③ 含量測定,a.單組分的測定方法,,,,b. 兩組分測定方法： 計算分光光度法,,,2.熒光分析法,⑴ 原理：物質(zhì)在受到激發(fā)光（λex）照射后產(chǎn)生了較長波長的熒光（λem）溶液的熒光強(qiáng)度和溶液的吸光程度、溶液中熒光物質(zhì)的熒光效率等因素有關(guān)。,F：熒光強(qiáng)度 K’：熒光效率I0：入射光強(qiáng)度 C：熒光物質(zhì)的濃度E：吸收系數(shù) l：

43、液層的厚度,,,⑵ 應(yīng)用,① 鑒別：λex和λem 熒光激發(fā)光譜, 發(fā)射光譜,② 含量測定：,a.標(biāo)準(zhǔn)曲線法,b.比例法（對照法）,③ 說明,a. 藥物本身無熒光：加衍生試劑（熒胺、鄰苯二甲醛（OPA）丹酰氯）,使成熒光物質(zhì)后測定。,b.熒光測定影響因素多：溶劑、pH值、散射光、熒光物質(zhì)濃度故做空白試驗，不易測得絕對熒光強(qiáng)度。,,,3.紅外分光光度法⑴原理：由分子的振動及轉(zhuǎn)動能級躍遷而引起的。一束具有連續(xù)波長的紅外光

44、通過物質(zhì)時，當(dāng)物質(zhì)分子中某個基團(tuán)的振動頻率和紅外光的頻率一致時，分子便吸收能量并發(fā)生躍遷。根據(jù)分子吸收紅外光的情況進(jìn)行分析的方法為紅外分光光度法.,⑵應(yīng)用,①已知化合物的鑒定： a.同時測定樣品和標(biāo)準(zhǔn)品吸收光譜 b.樣品圖譜與標(biāo)準(zhǔn)品的吸收光譜比較,,,②未知化合物的研究,有機(jī)化合物官能團(tuán)推定結(jié)構(gòu)細(xì)節(jié),如共軛結(jié)構(gòu)、脂環(huán)、芳環(huán)及其取代情況等推定分子骨架,功能團(tuán)位置和分子的主體結(jié)構(gòu).,③藥物的純度檢查雜質(zhì)有自身吸收峰, 使純物質(zhì)紅外

45、光譜吸收峰增多,通過圖譜可推斷含有某雜質(zhì).,④含量測定,選擇一個預(yù)測成分的特征吸收峰,此吸收峰不被其他成分干擾即可.定量時多采用內(nèi)標(biāo)法,依對照品比較法公式計算含量.,,,紅外吸收光譜特征性較強(qiáng)常用于物質(zhì)的鑒定時比UV法更可靠.,操作麻煩﹑測定的準(zhǔn)確度及精密度, 不如UV法, 用作含量測定的較少.,四 光譜法,⒈ TLC,⑴原理：吸附劑對不同化合物的吸附力不同,展開劑對各組分的溶解解吸能力不同,使待分離的組分Rf值不同,不同物質(zhì)最

46、后形成相互分離的斑點(diǎn).,⑵應(yīng)用①定性分析 樣品、對照品在同一薄層板上點(diǎn)樣展開 要求Rf 值斑點(diǎn)顏色一致.,②雜質(zhì)檢查,對照品對照法高低濃度對照法,雜質(zhì)斑點(diǎn)的數(shù)目及顏色不得超過規(guī)定.,,,,第二節(jié) 藥典常用分析方法,五 色譜法,③ 定量分析,c.采用薄層掃描儀直接在薄層板上測定,a.目視法,b.浦集斑點(diǎn)洗脫后測定,,,2.氣相色譜法（GC）,⑴原理 樣品中各組分在固定相與載氣間分配,由于各組分的分配系數(shù)不同而分離

47、,⑵一般要求（ChP）①載氣：N2②色譜柱：填充柱 毛細(xì)管柱③進(jìn)樣口溫度：高于柱溫30-50℃④進(jìn)樣量：不大于數(shù)微升⑤檢測器：常用氫焰離子化檢測器（FID） 檢測溫度一般高于柱溫,不得低于 100℃,以免水氣凝結(jié),常用250-350℃.,,,⑶系統(tǒng)適用性試驗（ChP）,①色譜柱的理論板數(shù)（n）,② 分離度（R）,③ 拖尾因子,④重復(fù)性 取各品種項下的對照溶液,連續(xù)

48、進(jìn)樣5次,除另有規(guī)定外,其峰面積測定值的相對標(biāo)準(zhǔn)差應(yīng)≯2.0%,,,,第二節(jié) 藥典常用分析方法,五 色譜法,⑷應(yīng)用①定性：根據(jù)tR,②含量測定：a內(nèi)標(biāo)法 b外標(biāo)法,③雜質(zhì)檢查,a 峰面積歸一化法b 主成分自身對照法c 內(nèi)標(biāo)法測定供試品中雜質(zhì)的總量限度d 內(nèi)標(biāo)法加校正因子測定供試品中某個 雜質(zhì)含量e 外標(biāo)法測定供試品中某個雜質(zhì)的含量,⒊ HPLC,分類： ⑴ 液—固吸附柱色譜法

49、 ①   液—液分配柱色譜法 ②   離子交換柱色譜法 ③   分子排阻塞譜法,,,,第二節(jié) 藥典常用分析方法,五 色譜法,⑵ 液-液分配柱色譜法,原理:根據(jù)物質(zhì)在兩相不相混容的溶劑間溶解度不同,而具有不同分配系數(shù),從而達(dá)到分離。,,,,第二節(jié) 藥典常用分析方法,五 色譜法,常用反相液-液色譜法,流動相：水、甲醇-水、乙腈-水

50、固定相：十八烷基硅烷鍵合硅膠 （ODS或C8）,,,,第二節(jié) 藥典常用分析方法,五 色譜法,系統(tǒng)適用性試驗應(yīng)用:鑒別﹑檢查﹑含量測定同GC,第四章　藥物定量分析與分析方法驗證第一節(jié)      定量分析樣品的前處理方法一、概述 含金屬或鹵素的藥物，如葡萄糖酸銻鈉，硬脂酸鎂、碘苯酯、磺溴酞鈉等，在分析前需要經(jīng)過不同方法處理之后，方可進(jìn)行測定。

51、處理方法因金屬或鹵素在分子中結(jié)合的牢固程度而異，如：有機(jī)鹵素藥物，所含鹵素原子均直接與碳原子相連，但不同藥物中鹵素所處的位置不同，則與碳原子結(jié)合的牢固程度就有差異。如果鹵素和芳環(huán)相連接，則結(jié)合牢固，與脂肪鏈的碳原子相連接，則結(jié)合不牢固；,而含金屬的有機(jī)藥物，有兩種情況：　　一是金屬原子不直接與碳原子相連，通常為有機(jī)酸及酚的金屬鹽或配位化合物，稱為含金屬的有機(jī)化合物，其分子結(jié)構(gòu)中的金屬原子結(jié)合不夠牢固，在水溶液中既可離解出金屬離子，如

52、有機(jī)結(jié)構(gòu)部分不干擾分析時，可在溶液中直接進(jìn)行其金屬的鑒別或含量定；　二是金屬原子直接與碳原子以共價鍵相連接，結(jié)合狀態(tài)比較牢，稱為有機(jī)金屬藥物，在溶液中其金屬一般不能解離成離子狀態(tài)，應(yīng)該根據(jù)共價鍵的牢固程度，經(jīng)適當(dāng)處理，將其金屬轉(zhuǎn)變?yōu)檫m于分析的狀態(tài)，應(yīng)該根據(jù)共價鍵的牢固程度，經(jīng)適當(dāng)處理，將其金屬轉(zhuǎn)變?yōu)檫m于分析的狀態(tài)（多轉(zhuǎn)變?yōu)闊o機(jī)的金屬鹽或離子），方可進(jìn)行其金屬的鑒別或含量測定。,二、不經(jīng)有機(jī)破壞的分析方法（一）  

53、; 直接測定法 凡金屬原子不直接與碳原子相連的含金屬藥物或某些C-M（金屬原子直接與碳原子相連）鍵結(jié)合不牢固的有機(jī)金屬藥物，在水溶液中可以電離，因而不需有機(jī)破壞，可直接選用適當(dāng)?shù)姆椒ㄟM(jìn)行測定 。,（二）經(jīng)水解后測定法 1．直接回流后測定法 2．用硫酸水解后測定法（三）經(jīng)氧化還原后測定法 1．  堿性還原后測定,2．  酸性還原后測定 3．  利用藥物中可游離的金屬離子的

54、氧化性測定含量三、 經(jīng)有機(jī)破壞的分析方法（一） 濕法破壞 1．  硝酸-高氯酸法 2．  硝酸-硫酸法 3．  硫酸-硫酸鹽法 4．  其它濕法,（二） 干法破壞,（三） 氧瓶燃燒法氧瓶燃燒法（oxygen flask combustion method）系將有機(jī)藥物放入充滿氧氣的密閉的燃燒瓶中進(jìn)行燃燒，并將燃燒所產(chǎn)生的欲測物質(zhì)吸收

55、于適當(dāng)?shù)奈找褐校缓蟾鶕?jù)欲測物質(zhì)的性質(zhì)，采用適宜的分析方法進(jìn)行鑒別、檢查或測定含鹵素有機(jī)藥物或含硫、氮、硒等其它元素的有機(jī)藥物。,本法是快速分解有機(jī)物的簡單方法，它不需要復(fù)雜設(shè)備，就能使有機(jī)化合物中的待測元素定量分解成離子型。該方法被各國藥典所收載。 1．  儀器裝置 燃燒瓶為500ml、1000ml、或2000ml磨口、硬質(zhì)玻璃錐形瓶，瓶塞應(yīng)嚴(yán)密、空心、底部熔封鉑絲一根（直徑為1mm），鉑絲

56、下端做成網(wǎng)狀或螺旋狀，長度約為瓶身長度的2∕3 ，如圖,2．  稱樣3．  燃燒分解操作法4．  吸收液的選擇,第二節(jié) 定量分析方法的特點(diǎn),容量分析法光譜分析法 色譜分析法,容量分析法,容量分析法：用已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，滴定一定體積的待測溶液，直到化學(xué)反應(yīng)完全為止，到達(dá)終點(diǎn)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積和濃度計算待測物質(zhì)含量的方法。特點(diǎn)：簡便，快速，準(zhǔn)確度高，專屬性較差（化學(xué)原料藥分析）,容

57、量分析法,滴定度每1 ml標(biāo)準(zhǔn)滴定液相當(dāng)待測物的mg數(shù)。滴定度計算,,容量分析法,直接滴定法的結(jié)果計算,,,V為滴定液的消耗體積(ml)；T為滴定度；W為供試品的稱樣量(g)；10－3為質(zhì)量換算因數(shù)(1mg等于10－3g)；F為滴定液的濃度校正因數(shù)。,,光譜分析法,光譜分析法是通過測定被測物質(zhì)在特定波長處或一定波長范圍內(nèi)的吸光度或發(fā)光強(qiáng)度，對該物質(zhì)進(jìn)行定性、定量分析的方法。 單色光穿過吸光物質(zhì)溶液時，在一定的濃度范圍內(nèi)，被該

58、物質(zhì)吸收的光量與該物質(zhì)溶液的濃度和液層的厚度（光路長度）成正比。其關(guān)系式如下：,,紫外-可見分光光度法,紫外-可見分光光度法用于藥物含量測定的方法有三種：1 對照品比較法 分別配制供試品和對照品溶液，在規(guī)定波長處分別測定吸光度，按下式計算供試品溶液中被測組分的濃度。CX=（AX/AR）CR 2 吸收系數(shù)法 按各品種項下方法，配制供試品溶液，在規(guī)定波長處測定其吸光度，再根據(jù)吸收系數(shù)按下式計算供試品溶液的濃度。,,,紫外-可見

59、分光光度法,3 比色法 供試品本身在紫外-可見區(qū)沒有強(qiáng)吸收，或在紫外區(qū)雖有吸收但為了避免干擾或提高靈敏度，可加入適當(dāng)?shù)娘@色劑顯色后測定用比色法測定時，由于顯色時影響的因素較多，應(yīng)取供試品與對照品同時操作。除另有規(guī)定外，比色法所用的空白系指用同體積的溶劑代替對照品或供試品溶液，然后依次加入等量的試劑，并用同樣方法處理，在規(guī)定的波長處測定吸光度后，按對照品比較法公式計算供試品溶液的濃度。,色譜法,色譜法（chromatograph

60、y）是利用混合物不同組分在兩相中具有不同的分配系數(shù)（或吸附系數(shù)、滲透性等），當(dāng)兩相作相對運(yùn)動時，不同組分在兩相中進(jìn)行多次反復(fù)分配實現(xiàn)分離后，通過檢測器得以檢測，進(jìn)行定性定量分析。,色譜系統(tǒng)適用性試驗,系統(tǒng)適用性試驗指用規(guī)定的對照品對色譜系統(tǒng)進(jìn)行試驗和調(diào)整，應(yīng)達(dá)到的要求。系統(tǒng)適用性試驗通常包括最小理論板數(shù)、分離度、重復(fù)性和拖尾因子。（一）色譜柱的理論板數(shù)（n）在選定的色譜條件下，測定主成分或內(nèi)標(biāo)物色譜峰的保留時間（tR）和半峰寬（W1

61、/2），按塔板理論公式計算色譜柱的理論板數(shù)。如果測得的理論板數(shù)低于各品種項下規(guī)定的最小理論板數(shù)，應(yīng)改變色譜柱的某些條件（如柱長、載體性能、色譜柱填充的優(yōu)劣等），使理論板數(shù)達(dá)到要求。,,（二）分離度（R）定量分析時，為便于準(zhǔn)確測量，要求定量峰與其他峰或內(nèi)標(biāo)峰之間有較好的分離度。除另有規(guī)定外，分離度應(yīng)大于1.5。（三）重復(fù)性取各品種項下的對照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣5次，除另有規(guī)定外，其峰面積測量值的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差應(yīng)不大于2.0%。,

62、,（四）拖尾因子為保證測量精度，特別當(dāng)采用峰高法測量時，應(yīng)檢查待測峰的拖尾因子是否符合各種項下的規(guī)定。拖尾因子（T）以下式計算：,,,,除另有規(guī)定外，T 應(yīng)在0.95～1.05之間。,,第三節(jié) 藥品分析方法的驗證,一、目的,證明所采用的分析方法適合于相應(yīng)的檢測要求，方法驗證過程和結(jié)果均應(yīng)記載在藥品標(biāo)準(zhǔn)起草和修訂說明中。,二、用途,1、藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)起草時，分析方法需經(jīng)驗證。,2、藥物合成方法變更、制劑的組分變更、原分析方法進(jìn)行修訂時，

63、分析方法需經(jīng)驗證。,三、需驗證的分析項目,1. 鑒別試驗；2. 雜質(zhì)定量或限度檢查；3. 原料或制劑中有效成分含量測定；4. 制劑中其它成分（降解產(chǎn)物、防腐劑等）的測定；5. 溶出度、釋放度等功能檢查中的溶出量等的測試方法。,驗證內(nèi)容有：準(zhǔn)確度、精密度（重復(fù)性、中間精密度和重現(xiàn)性）、專屬性、檢測限、定量限、線性、范圍和耐用性,四、驗證內(nèi)容,（一） 準(zhǔn)確度（accuracy） 準(zhǔn)確度是

64、指用該方法測定的結(jié)果與真實值或參考值接近的程度，用百分回收率表示。,原料藥可用已知純度的對照品或樣品進(jìn)行測定，或用本法所得結(jié)果與已建立準(zhǔn)確度的另一方法測定的結(jié)果進(jìn)行比較。,制劑可用含己知量被測物的各組分混合物進(jìn)行測定，即采用在空白輔料中加入原料藥對照品的方法。 如不能得到制劑的全部組分，可向制劑中加入已知量的被測物進(jìn)行測定。,回收試驗空白+已知量A的對照品（或標(biāo)準(zhǔn)品）測定，測定值為M,,加樣回收試驗 已準(zhǔn)確測定藥

65、物含量P的真實樣品+已知量A的對照品（或標(biāo)準(zhǔn)品）測定，測定值為M,,數(shù)據(jù)要求 規(guī)定的范圍內(nèi)，至少用9次測定結(jié)果評價，如制備三個不同濃度樣品各測三次。,（二）精密度（precision） 精密度是指在規(guī)定條件下，同一個均勻樣品，經(jīng)多次取樣測定所得結(jié)果之間的接近程度。用偏差（d）、標(biāo)準(zhǔn)偏差(SD)、相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)（變異系數(shù)，CV）表示。,偏差（d）：測量值與平均值之差,標(biāo)準(zhǔn)（偏）差（SD或S）,相對標(biāo)準(zhǔn)（偏）差（

66、RSD），也稱變異系數(shù)（CV）,1. 重復(fù)性 在相同條件下，由同一個分析人員測定所得結(jié)果的精密度；在規(guī)定的范圍內(nèi)，至少用9次測定結(jié)果評價，如制備三個不同濃度樣品各測三次或把被測物濃度當(dāng)作100%，至少測6次進(jìn)行評價。,2. 中間精密度 同一實驗室，不同時間由不同分析人員用不同設(shè)備所得結(jié)果的精密度?？疾祀S機(jī)變動因素的影響。變動因素為不同日期、不同分析人員、不同設(shè)備,3. 重現(xiàn)性 不同實驗室，不同分析人員測

67、定結(jié)果的精密度。當(dāng)分析方法將被法定標(biāo)準(zhǔn)采用時，應(yīng)進(jìn)行重現(xiàn)性試驗。如建立藥典分析方法時通過協(xié)同檢驗得出重現(xiàn)性結(jié)果，協(xié)同檢驗的過程、重現(xiàn)性結(jié)果均應(yīng)記載在起草說明中。,（三） 檢測限（limit of detection， LOD） 檢測限系指試樣中被測物能被檢測出的最低量。是限度試驗參數(shù)，無需定量測定。,1．非儀器分析目視法 用已知濃度的被測物，試驗出能被可靠地檢測出的最低濃度或量。,2．信噪比法 用于能

68、顯示基線噪音的分析方法（儀器分析方法），是把已知低濃度試樣測出的信號與空白樣品測出的信號進(jìn)行比較，算出能被可靠地檢測出的最低濃度或量。一般以信噪比（S/N）3∶1或2∶1時的相應(yīng)濃度或注入儀器的量確定檢測限。,3．?dāng)?shù)據(jù)要求 應(yīng)附測試圖譜，說明測試過程和檢測限結(jié)果。,（四）定量限（1imit of quantitation，LOQ） 指樣品中被測物能被定量測定的最低量，結(jié)果應(yīng)具有一定準(zhǔn)確度和精密度。常用%、ppm、pp