紫色稻生理生化特性研究【畢業(yè)論文+開題報告+文獻綜述+外文翻譯】

1、<p><b>　　本科畢業(yè)設計</b></p><p><b>　?。?0_ _屆）</b></p><p><b>　　生物工程</b></p><p>　　紫色稻生理生化特性研究</p><p><b>　　摘 要</b></p&g

2、t;<p>　　本文以寧波市余姚河姆渡稻作生物技術有限公司基地種植的2個水稻品種（紫色稻及其親本）為材料，研究了不同類型水稻品種的內在生理生化特性，如苯丙氨酸解氨酶（PAL）、多酚氧化酶（PPO）、過氧化氫酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）的活性及葉綠素含量等。結果表明紫色水稻葉綠素含量要略高于其親本，而苯丙氨酸解氨酶、多酚氧化酶、過氧化氫酶、超氧化物歧化酶的活性測定表明從普通雜交水稻突變而來的紫葉水稻除PAL活性外，

3、其它酶活性比普通雜交水稻要高。</p><p>　　關鍵詞：水稻；生理生化特性；葉色突變體</p><p><b>　　ABSTRACT</b></p><p>　　In this study, two cultivars of rice（purple rice and its parent） from Yuyao Hemudu Ningbo

4、were used to investigate the effect on the physiological and biochemical characteristics (including phenylalanine ammonia lyase (PAL), polyphenol oxidase (PPO), catalase (CAT), peroxidase (POD) activity and chlorophyll c

5、ontent, etc.) of different cultivar. The results showed that the chlorophyll content of the purple rice to be slightly higher than its parent, and for PAL, PPO, CAT, SOD, the purple leaf- m</p><p>　　Key wor

6、ds: Rice; physiological and biochemical characteristics; leaf- mutant目 錄</p><p><b>　　1 前言1</b></p><p>　　1.1 水稻葉色突變體簡介1</p><p>　　1.2 水稻葉色突變體的分子機制1</p><p>

7、;　　1.2.1 葉綠素生物合成和降解途徑中的基因突變1</p><p>　　1.2.2 血紅素一光敏色素生色生物途徑中基因突變1</p><p>　　1.2.3 與光合系統(tǒng)無直接關系基因突變2</p><p>　　1.3 水稻紫葉突變體的研究進展2</p><p><b>　　2 材料和方法2</b><

8、/p><p>　　2.1 材料與儀器2</p><p>　　2.1.1 材料2</p><p>　　2.1.2 儀器2</p><p>　　2.1.3 試劑3</p><p>　　2.1.4 其他用品3</p><p>　　2.1.5 主要試劑配制3</p><p&g

9、t;　　2.2 實驗方法4</p><p>　　2.2.1 樣品預處理4</p><p>　　2.2.2 主要生理生化特性測定4</p><p><b>　　3 結果與分析7</b></p><p>　　3.1 苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性評價7</p><p>　　3.2 多酚氧化酶（

10、PPO）活性評價8</p><p>　　3.3 過氧化氫酶（CAT）活性評價9</p><p>　　3.4 超氧化物歧化酶活性（SOD）活性評價9</p><p>　　3.5 葉綠素含量分析10</p><p><b>　　4 結論11</b></p><p><b>　　參考

11、文獻11</b></p><p><b>　　1 前言</b></p><p>　　水稻是最重要的糧食作物之一，水稻是我國最主要的糧食作物，居全國三大糧食作物之首；世界有1/3以上的人口以之為主食，如何有效提高水稻產量，已經成為水稻栽培和育種急需解決的重大課題。通過生物中各種變異，可以篩選出更高品質的動植物新品種[1]。</p><p

12、>　　1.1 水稻葉色突變體簡介</p><p>　　葉色突變的主要是葉色表型發(fā)生了變異，目前分類方法有很多，Gustaftsson根據苗期葉色表型將其分為5個主要類型：白化、黃化、淺綠、條紋和斑點。而Awan等將葉色突變體進一步分為白化、黃化、淺綠、白翠、綠白、黃綠、綠黃和條紋8種類型。正常葉色是植物長期進化的結果，而葉色突變通常影響突變體的光合速率，往往會導致植物發(fā)育遲緩、競爭力下降，及造成作物減產，嚴

13、重時，甚至導致植株死亡。</p><p>　　葉色突變是水稻中較常見的一種突變類型，在水稻功能基因組研究、植物光合作用的生理生化機制研究和遺傳育種應用等方面具有無可替代的價值[2]。在育種中，葉色突變不僅可以作為標記性狀，簡化良種繁育和雜交種生產，提高雜交種種子純度，而且常綠突變體還可為高光效育種提供優(yōu)良的種質資源；另外，葉色突變體也是光合作用、光形態(tài)建成、激素生理、質-核基因互作以及信號傳導途徑等水稻光合系統(tǒng)結

14、構、功能及其調控機理研究的理想材料[3]。</p><p>　　1.2 水稻葉色突變體的分子機制</p><p>　　水稻葉色突變是生理和遺傳共同作用的結果，它的分子機制較為復雜。Nilon比較了理化誘變劑誘發(fā)單位葉綠素合成缺陷突變體和幼苗生長突變體的頻率，認為約有700個位點與葉綠素突變有關[2]?？偟膩碚f，葉色突變就是在一定的環(huán)境因素影響下，從而直接或間接的影響葉綠素的合成代謝，最終產

15、生葉色突變的表型。</p><p>　　根據對葉色突變體的研究，目前，對其發(fā)生機制主要歸納為以下幾點。</p><p>　　1.2.1 葉綠素生物合成和降解途徑中的基因突變</p><p>　　綠色植物和某些藻類的葉綠素形成從谷氨酰tRNA開始，至葉綠素a、b合成結束[4]。葉綠素的生物合成是一個十分復雜的酶促反應過程，其中涉及到的任何一個基因發(fā)生突變，都可能會導致

16、葉綠素的合成受到阻礙，從而顯現出不同程度的葉色變異。黃化、淺綠、斑點是由于葉綠素合成鎂的鰲合形成部位受阻，如水稻的斑馬葉[5]。</p><p>　　1.2.2 血紅素一光敏色素生色生物途徑中基因突變</p><p>　　葉綠素生物合成與血紅素生物合成是四毗咯生物合成途徑的兩個分支，原葉琳Ix與Mg2+鰲合產生鎂原葉琳Ix，與Fe2+鰲合形成血紅素，血紅素經一系列反應最終形成光敏色素生色團

17、。葉綠素合成速率受細胞內血紅素含量影響，若血紅素一光敏色素生色團途徑受阻、細胞內血紅素含量上升，過剩的血紅素將反饋抑制葉綠素合成，引起突變體葉色變異[6]。</p><p>　　1.2.3 與光合系統(tǒng)無直接關系基因突變</p><p>　　光合系統(tǒng)以外基因變異亦可以引起葉色表型變異，但突變機制尚未得到明確的解釋。如質-核信號傳導途徑受阻，大量研究表明，細胞核與質體之間存在著一個信號通路，通

18、過這一信號傳導，核基因產物可以調控質體基因的轉錄和翻譯，質體的代謝及發(fā)育狀態(tài)也能夠影響編碼質體蛋白質的類核基因的表達[3]。</p><p>　　1.3 水稻紫葉突變體的研究進展</p><p>　　紫葉突變體作為葉色突變體的一種，它的性狀識別明顯，受環(huán)境影響小，遺傳性狀較穩(wěn)定。因此，其在水稻分類、遺傳研究和育種實踐上都有很大的作用。紫葉突變性狀大多是由于花青素含量的大量增加而引起的紫葉突

19、變基因作為標記基因導入不育系實現了雜交水稻種子純度的室內鑒定，簡化了雜交水稻育種的流程[7]。</p><p>　　通過紫葉表型不但可以測定種子純度，還可以在苗期剔除受外源花粉污染的種子和假雜種，并且在良種繁育和雜交育種上有廣闊的應用前景。若能將品質和利用價值結合選育出一種品質優(yōu)良的紫葉突變體，將具有重要意義[8]。</p><p>　　對一些紫葉突變體的基因定位、遺傳及光合生理特性的研究

20、表明，水稻紫色葉突變體的遺傳是由一對或幾對隱性的核基因控制的，且它葉色變紫是逐步的。剛長出的新葉片表現為正常的綠色，隨后從葉尖向下葉色逐漸的變?yōu)樽仙?，穗部的也表現出相同的葉色變化規(guī)律[9]。</p><p>　　總之，對紫色葉色的標記不僅實現了既可簡便、經濟、快速確定種子純度，為種子質量預警，又可在制、繁種標一記輔助去雜，并在生產中能一定程度地自動剔除假雜種，在兩系雜交水稻的生產應用中的市場應用前景極其廣闊。&l

21、t;/p><p>　　目前還沒見有對紫葉水稻植株的生理生化特性研究，本文以寧波余姚河姆渡水稻基地的2個水稻品種（紫色稻及其親本）為材料，研究了不同品種對內在生理生化特性（包括苯丙氨酸解氨酶（PAL）、多酚氧化酶（PPO）、過氧化氫酶（CAT）、過氧化物酶（POD）的活性及葉綠素含量等）的影響，以期能夠為紫色稻的栽培技術研究提供一定的基礎性數據。</p><p><b>　　2 材料和

22、方法</b></p><p><b>　　2.1 材料與儀器</b></p><p><b>　　2.1.1 材料</b></p><p>　　實驗材料分別采自寧波余姚河姆渡水稻基地的2個水稻品種（紫色稻及其親本），各對照樣品均取自同一采收時間，樣品均鑒定無誤。</p><p><

23、b>　　2.1.2 儀器</b></p><p>　　本研究所采用的主要儀器和設備如表1所示。</p><p>　　表1 主要儀器和設備</p><p><b>　　2.1.3 試劑</b></p><p>　　表2 主要藥品和試劑</p><p><b>　　續(xù)表

24、2</b></p><p>　　2.1.4 其他用品</p><p>　　研缽、具塞刻度試管、10mL、100mL、1L容量瓶、刻度吸管、50mL三角瓶、100mL量筒、100mL吸量筒、10mL刻度試管、10mL、100mL、1L燒杯、酸式滴定管、蒸餾水、手術剪刀、一次性手套、一次性橡膠手套。</p><p>　　2.1.5 主要試劑配制</p&

25、gt;<p>　　0.1mol/L高錳酸鉀標準液：稱取高錳酸鉀3.1605g，用新煮沸冷卻蒸餾水配制成1000mL，再用0.1mol/L草酸鈉溶液標定。</p><p>　　0.1mol/LH2O2：市售30%H2O2大約等于17.6mol/L，取30%H2O2溶液5.68mL，稀釋至1000mL，用標準0.1mol/L高錳酸鉀溶液（在酸性條件下）進行標定。</p><p>

26、　　0.1mol/L草酸鈉溶液：稱取已烘干至恒重的草酸鈉11.1667g，用蒸餾水溶解后，定容至1000mL。</p><p>　　0.02mol/L苯丙氨酸溶液：稱取3.3038g苯丙氨酸，用0.1mol/LpH8.8硼酸緩沖液定容至1000mL。</p><p>　　0.1mol/L鄰苯二酚溶液：稱取1.1011g鄰苯二酚，用蒸餾水定容至100mL。</p><p&

27、gt;　　130mmol/L甲硫氨酸溶液：稱取1.9389g甲硫氨酸用磷酸緩沖液溶解定容至100mL。</p><p>　　750µmol/L氮藍四唑溶液：稱取0.06133gNBT用磷酸緩沖液定容至100mL，避光保存。</p><p>　　100µmol/LEDTA-Na2溶液：稱取0.03721gEDTA-Na2，用磷酸緩沖液定容至1000mL。</p>

28、;<p>　　20µmol/L核黃素溶液：稱取0.0753g核黃素用蒸餾水定容至1000mL，避光保存。</p><p><b>　　2.2 實驗方法</b></p><p>　　2.2.1 樣品預處理</p><p>　　將新鮮水稻植株洗凈后晾干水分，剪下葉、莖、籽粒，置于-40℃冰箱分裝保存。</p>

29、<p>　　2.2.2 主要生理生化特性測定</p><p>　　2.2.2.1 苯丙氨酸解氨酶（PAL）活力測定</p><p>　　苯丙氨酸解氨酶（phenylatanine ammonia—lyase，PAL，E.c4.3.1.5）是)催化L-苯丙氨酸解氨生成反式肉桂酸，是連接初級代謝和苯丙烷類代謝，催化苯丙烷類代謝途徑第一步反應的酶，也是這個途徑的關鍵酶和限速酶，對植物具

30、有非常重要的生理意義[10]。它催化L-苯丙氨酸的脫氨反應，釋放氨而形成肉桂酸。根據產物反式肉桂酸在波長290nm光密度下的變化，可以測定該酶的活性。</p><p>　　苯丙氨酸解氨酶活性（酶單位/g鮮重）=A*V/（0.01*a*W*t）</p><p>　　式中：A為反應時間內吸光度的變化值；V為酶提取液總量（mL）；t為反應時間（h）；W為樣品鮮重（g）；a為測定時酶液用量（mL）

31、；以每小時在290nm處吸光度變化0.01所需酶量定義為一個酶活性單位。</p><p>　　本次測定參考相關文獻進行操作[11-15]。</p><p>　　酶液制備：取預處理過的待測植物樣1g置于缽，加入0.5g聚乙烯吡咯烷酮（PVP）和少量石英砂，并加10mL含5mmol/L的巰基乙醇并預冷的硼酸緩沖液冰浴研磨。研磨后置于離心管中，用10ml預冷的硼酸緩沖液洗滌研缽兩次，一并倒入離心

32、管，在4℃下10000r/min離心15min，上清液即為粗酶液。</p><p>　　酶活性測定：取4支10mL試管（3支測定管，1支對照管），分別加入0.02mol/L L-苯丙氨酸1.0mL（對照管不加，代之為蒸餾水），硼酸緩沖液2.0mL，酶液1.0mL，總體積4.0mL。搖勻后置于30℃恒溫水浴保溫0.5h后，加0.2mL 6mol/L HCL終止，用對照管調零后，立即用紫外分不光光度計在290nm處檢

33、測測定管反應液的吸光值（以上實驗均做3個平行）。</p><p>　　2.2.2.2 多酚氧化酶（PPO）活力測定</p><p>　　多酚氧化酶（Polyphenol oxidase，PPO）是植物體內普遍存在的一種非線粒體內的末端氧化酶，它包括單酚氧化酶（酪氨酸酶（tyrosinase），EC.1.10.3.2）、雙氧化酶（兒茶酚氧化酶（catechol oxidase），EC.1.1

34、0.3.2）、漆酶（laccase，EC.1.10.3.1）；它可以把酚類物質如單酚、鄰苯二酚、鄰苯三酚、對苯二酚等氧化為相應的醌類物質[16]。多酚氧化酶活性可以用用比色法測量產物的形成，常用的底物如兒茶酚（鄰苯二酚）和3,4-二羥苯丙氨酸。常用鄰苯二酚（兒茶酚）通過比色法測量產物的形成，以此來測定多酚氧化酶的活力。本次測定參考朱廣廉等[16]敘述的測定方法進行。</p><p>　　多酚氧化酶活力（0.01A

35、*min-1）=A*D/（0.01*W*t*a）</p><p>　　式中：A為反應時間內吸光度的變化值；D為稀釋倍數，即提取的總酶液為反應系統(tǒng)內酶液體積的倍數；t為反應時間（min）；W為樣品鮮重（g）；a為測定時酶液用量（mL）；以每min內A525值變化0.01為1個酶活力單位。</p><p>　　酶液制備[11-15]：稱取已經過預處理的樣品2g置于研缽中，加入0.5g聚乙烯吡咯

36、烷酮和預冷的5mL 0.1mol/L pH6.5磷酸緩沖液，再加入少量石英砂磨成勻漿，倒入離心管，用5ml磷酸緩沖液洗滌研缽兩次一并倒入離心管，然后加入30%飽和度硫酸銨，10000rpm/min離心除沉淀，上清液再加硫酸銨使達60%飽和度，15000rpm/min離心收集沉淀。將所得沉淀重新溶于10mL 0.01mol/L pH6.5磷酸緩沖液即為酶液，以上操作均在4℃下進行。</p><p>　　酶活力的測定

37、：在試管中加入2.0mL 0.05mol/L pH5.5磷酸緩沖液，1.0mL 0.1ml/L鄰苯二酚，1.0mL酶液，搖勻后迅速于525nm波長處測定吸光值，然后倒入試管中，放入37℃恒溫水浴中保溫10min，加入三氯乙酸終止反應，離心取上清液。于525nm波長處測定吸光值（以上實驗均做3個平行）。</p><p>　　2.2.2.3 過氧化氫酶（CAT）活力測定</p><p>　　過

38、氧化氫酶（CAT）是一種血紅蛋白酶，它能催化過氧化氫分解為水和分子氧，達到清除細胞內過氧化氫的目的，此過程中過氧化氫既是氧化劑又是還原劑?？筛鶕﨟2O2的消耗量或O2的生成量測定該酶活力大小。測定過氧化氫酶的方法有測壓法、滴定法以及分光光度法等。酶活性用每g鮮重樣品1min內OD變化值表示：</p><p>　　過氧化氫酶活性（A*g-1*min-1）=A*V/（0.01*W*a*t）</p>&l

39、t;p>　　式中：A為反應時間內吸光度的變化值；V為酶提取液總量（mL）；t為反應時間（min）；W為樣品鮮重（g）；a為測定時酶液用量（mL）；將每分鐘OD的減少0.01定義為一個酶活力單位。</p><p>　　酶液提取[11-15]：取樣品2g加入已預冷的0.1mol/L磷酸緩沖溶液（pH7.0）5ml，研磨成勻漿，轉移至離心管中；再用用該緩沖液5ml沖洗研缽兩次，并將沖洗液轉入離心管中；15000r

40、/min離心15min，上清液即為過氧化氫酶的粗提液，以上操作均在4℃下進行。</p><p>　　活性測定：在4mL反應體系中，包括0.3%H2O21mL，H2O2.9mL，最后加入0.1mL酶液，啟動反應，測定240nm處的OD值減低速度（以上實驗均做3個平行）。</p><p>　　2.2.2.4 超氧化物歧化酶（SOD）活力測定</p><p>　　超氧化物

41、歧化酶（superoxide dismutase，SOD）是一種清除超氧陰離子自由基，普遍存在于動植物體內。由于超氧自由基（O2－）為不穩(wěn)定自由基，壽命極短，測定SOD活性一般為間接方法。核黃素在有氧條件下能產生超氧自由基負離子O2－，當加入NBT后，在光照條件下，與超氧自由基反應生成甲腙，它是一種藍色物質，在560nm波長下有最大吸收。當加入SOD時，可以使超氧自由基與H+結合生成H2O2和O2，從而抑制了NBT光還原的進行，使藍色甲

42、腙生成速度減慢。據此可以計算酶活性大小。</p><p>　　SOD活性單位以抑制NBT光化還原的50％為一個酶活性單位表示，按下式計算SOD活性。</p><p>　　SOD總活性＝（A0－As）*Vt/（A0*0.5*W*V1）</p><p>　　式中：A0為照光對照管的吸光度；As為樣品測定管的吸光度；Vt為樣品液總體積（mL）；V1為測定時樣品用量（mL）

43、；W為樣鮮重（g）。</p><p>　　酶液提?。悍Q取水稻樣品1~2g于預冷的研缽中，加入5mL預冷的50mmol/L(pH7.8)磷酸緩沖液，0.5gPVP在冰浴上研磨成漿，加緩沖液最終定容至10mL容量瓶中。取5mL提取液于4℃下10000r/min離心15min，上清液即為SOD粗提液。</p><p>　　活性測定[11-15]：在4mL反應體系中，包括0.3%H2O21mL、0

44、.2%愈創(chuàng)木酚1.0mL，pH7.0磷酸緩沖液1.7mL，最后加入0.3mL酶液，記錄470nmLOD增加速度。將每分鐘OD增加量定義為1個酶活力單位（以上實驗均做3個平行）。</p><p>　　顯色反應：取5mL試管（要求透明度好）7支，3支為測定管，另3支為對照管，還有一支空白對照。按表3加入各種溶液。</p><p>　　表3 各試劑加入量</p><p>

45、;　　混勻后將空白管置暗處，其他各管于4000lx日光下反應20min（要求各管受光情況一致，溫度高時間縮短，溫度低時間延長）。</p><p>　　2.2.2.5 葉綠素含量測定</p><p>　　高等植物光合作用過程中利用的光能是通過葉綠體色素（光合色素）吸收的。葉綠體色素由葉綠素a、葉綠素b、胡蘿卜素和葉黃素組成。葉綠素不溶于水，溶于有機溶劑，可用多種有機溶劑，如丙酮、乙醇或二甲基

46、亞砜等研磨提取或浸泡提取。葉綠色素在特定提取溶液中對特定波長的光有最大吸收峰，用分光光度計測定在該波長下葉綠素溶液的吸光度，再根據葉綠素在該波長下的吸收系數即可計算葉綠素含量。</p><p>　　色素的提取[14]：取預處理過新鮮葉片，減去粗大的葉脈，并剪成碎塊，稱取0.5克放入研缽中，加純丙酮5mL，少許碳酸鈣和石英砂，研磨成勻漿，再加80%丙酮5mL，將勻漿轉入離心管，并用適量80%丙酮洗滌研缽，一并轉入離

47、心管，離心后棄沉淀，上清液用80%的丙酮定容至25mL。</p><p>　　測定光密度值：取上述色素提取液1mL，加80%丙酮4mL稀釋后轉入比色皿中，以80%丙酮為對照，分別測定663nm、645nm處光密度值。根據測量得到的光密度A663、A645，代入以下式中：</p><p>　　Ca=12.7A663-2.69A645；Cb=22.9A645-4.68A663，</p&g

48、t;<p>　　即可計算溶液中葉綠素a和葉綠素b的含量，葉綠素總量為Ca+Cb。</p><p><b>　　3 結果與分析</b></p><p>　　3.1 苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性評價</p><p>　　苯丙氨酸解氨酶（phenylalanine ammonia lysase，PAL，E.C.4.3.1.5）是一種只存

49、在于植物及微生物細胞內的酶。PAL是連接生物初級代謝和苯丙烷類代謝、催化苯丙烷類代謝第一步反應的酶，是苯丙烷類代謝的關鍵酶和限速酶[17]。植物的代謝分為初級代謝和次級代謝，植物的次級代謝有多條途徑，苯丙烷類代謝途徑是其中很重要的一條，苯丙烷類途徑生成的黃酮、異黃酮、生物堿等次生代謝產物在植物的生長發(fā)育過程中起著重要的作用；在生物次生物質代謝中具有防紫外線傷害、抵抗病原體的侵害、保持花粉生活力及形成植物花青素等多種重要作用[10]。因此

50、PAL活性可以作為植物抗逆境能力的一個生理指標。</p><p>　　從圖1可看出，葉片的PAL活性，雜交水稻和紫色水稻的差異不是很明顯；從莖的活性看雜交水稻的活性相對較高；從籽粒的活性看，雜交水稻相對較高，而紫色水稻相對要低很多。這個結果有可能是葉色突變使水稻植株中的PAL活性發(fā)生了改變。</p><p>　　圖1 不同品種間PAL活性差異</p><p>　　

51、藍色為葉片，紅色為莖，綠色為籽粒；--1為雜交水稻，--2為紫色水稻</p><p>　　3.2 多酚氧化酶（PPO）活性評價</p><p>　　PPO是一類質體酶，主要存在于葉綠體、黃色體和白色體等內膜上，與分布于細胞質中的酚類底物在正常情況下是隔離的，只有當膜破裂，酶釋放出來，酶才會催化酚氧化。它可以把酚類物質如單酚、鄰苯二酚、鄰苯三酚、對苯二酚等氧化為相應的醌類物質；醌類物質對病原

52、微生物起著抑制作用或殺傷作用，具有一定的抗病能力。因此，在感病的植物體中，PPO活性都有不同程度的提高，以抵抗病原體進一步侵染健康的植物組織[18]。在植物中，該酶的分布與物種及年齡有關。不同物種或同一物種的不同品種，或同一植株的不同部位，甚至同一部位的不同發(fā)育時期，PPO的含量、種類都有所不同。一般來說，幼嫩部位的PPO含量高于老化部位[19]。</p><p>　　從圖2可看出，PPO的活性，紫色水稻的活性相

53、對較高，其中在葉片和莖中，活性差異較明顯；在籽粒中，紫色水稻略高于雜交水稻，但活性差異并不明顯。</p><p>　　圖2 不同品種間PPO活性差異</p><p>　　藍色為葉片，紅色為莖，綠色為籽粒；--1為雜交水稻，--2為紫色水稻</p><p>　　3.3 過氧化氫酶（CAT）活性評價</p><p>　　過氧化氫酶（Hydrog

54、en Peroxidase）又名觸酶（Catalase，CAT），是一種廣泛存在于生物組織中的氧化還原酶。生物體內的活性氧和自由基的積累，會導致膜脂過氧化，從而引起生物體本身代謝的紊亂。H2O2是有毒害作用的活性氧的前體[20]。CAT的功能主要清除體內的H2O2，從而使細胞免于遭受H2O2的毒害。</p><p>　　計算結果得到雜交水稻、富鋅水稻和紫色水稻葉片、莖、籽粒酶液的過氧化物酶活性（表4、表5、表6）

55、。</p><p>　　從表4、表5和表6可看出，在葉片中總體來說，雜交水稻和紫色水稻之間的差異不明顯；在莖稈中，雜交水稻相對較低，但與紫色水稻之間活性差異也不是很明顯；而在籽粒中，紫色水稻相對較低，但總體差異不是很明顯。</p><p>　　表4 不同品種水稻葉片CAT活性差異比較（U*g-1*min-1）</p><p>　　表5 不同品種水稻莖CAT活性差

56、異比較（U*g-1*min-1）</p><p>　　表6 不同品種水稻籽粒CAT活性差異比較（U*g-1*min-1）</p><p>　　注：--1為雜交水稻，--2為紫色水稻，表中數據為平均數±標準差</p><p>　　3.4 超氧化物歧化酶活性（SOD）活性評價</p><p>　　SOD是活性氧清除反應過程中第一個發(fā)揮作

57、用的抗氧化酶，能將超氧物陰離子自由基（O-2）快速歧化為過氧化氫（H2O2）和分子氧；在隨后的反應中，H2O2在過氧化氫酶（CAT）、各種過氧化物酶（APX）和抗壞血酸谷胱甘肽循環(huán)系統(tǒng)的作用下轉變?yōu)樗头肿友?；SOD對于清除氧自由基，防止氧自由基破壞細胞的組成、結構和功能，保護細胞免受氧化損傷具有十分重要的作用[21]。</p><p>　　由圖3可看出，水稻葉片中紫色水稻相對較高；而在莖稈中，紫色水稻活性較高，

58、雜交水稻略低；而在籽粒中SOD的活性很低，幾乎檢測不到，這可能是由于同一植物不同組織部位的SOD分布不同引起的。</p><p>　　圖3 不同品種間SOD活性差異</p><p>　　藍色為葉片，紅色為莖；--1為雜交水稻，--2為紫色水稻</p><p>　　3.5 葉綠素含量分析</p><p>　　葉片葉綠素含量與光合作用密切相關，是

59、反映葉片生理狀態(tài)的重要指標。在植物發(fā)育生理、光合生理及抗性生理研究中經常需要測定葉綠素含量。葉綠素含量也是指導作物栽培生產和選育作物品種的重要指標。</p><p>　　圖4顯示，從葉片來看，紫色水稻的葉綠色含量相對最高，普通雜交水稻相對略低；從莖稈來看，仍是紫色水稻的葉綠素含量最高，雜交水稻略低；而籽粒中幾乎檢測不到葉綠素的含量。</p><p>　　圖4 不同水稻品種間葉綠素含量差異&

60、lt;/p><p>　　藍色為葉片，紅色為莖；--1為雜交水稻，--2為紫色水稻 </p><p><b>　　4 結論</b></p><p>　　CAT在生物體內具有非常重要的生理功能，其中最主要的就是參與活性氧代謝過程。植物體在逆境時，活性氧代謝會加強，引起氧自由基增多，導致細胞內H2O2增多，H2O2會進一步產生羥自由基，它直接或間接氧化細

61、胞內大分子（如核酸、蛋白），破壞細胞膜結構，加速細胞衰老。植物體內存在保護酶系統(tǒng)（SOD、POD、CAT等），它們可以及時清除氧自由基、過氧化氫、羥自由基等，使細胞免受這類自由基的傷害，維持正常生理代謝。過氧化氫酶（CAT）是血紅蛋白酶，能催化過氧化氫分解為水和分子氧，達到清除細胞內過氧化氫的目的，所以它對于植物抗逆抗衰來說有著非常重要的意義[22]。</p><p>　　多酚氧化酶（PPO）是含銅的酶，它可以把

62、酚類物質如單酚、鄰苯二酚、鄰苯三酚、對苯二酚等氧化為相應的醌類物質；醌類物質對病原微生物起著抑制作用或殺傷作用，具有一定的抗病能力[18]。苯丙氨酸解氨酶（PAL）可催化L-苯丙氨酸還原脫氫生成反式肉桂酸，再進一步形成一系列羥基化肉桂酸衍生物，為植物保衛(wèi)素和木質素合成提供苯丙烷碳骨架或碳橋，有利于植物抗病性表達[23]。POD、PAL和PPO是植物體中的保護酶，它的強弱直接關系到植株抵御病害的能力。POD、PAL和PPO的活性越大其抗病

63、性越強，POD、PAL和PPO的活性越小，植株的抗病性越弱[24]。</p><p>　　實驗結果發(fā)現，對于PAL、PPO、CAT、SOD的活性測定，總的來說，從普通雜交水稻突變而來的紫葉水稻除PAL活性外，都較普通雜交水稻要好，這可以說明，突變后的水稻植株抗逆和抗衰性有所提高。</p><p>　　另外，紫色水稻突變體的葉綠素含量在整個植株中均略高于其親本，由此可以說明，該水稻的葉色變異

64、可能引起了水稻植株光合系統(tǒng)葉綠素的代謝合成發(fā)生了改變，最終導致了整個植株葉綠素含量的提高。</p><p>　　通過各酶活與葉綠素含量分布的對比得出，植株中各組織部位的酶活的高低與其葉綠素含量基本相一致，這可能是突變引起了植株光合特性的改變最終導致了各酶活性的改變。</p><p><b>　　參考文獻</b></p><p>　　[1] Aw

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75、農業(yè)科技,2008(4):54-56.</p><p><b>　　畢業(yè)論文開題報告</b></p><p><b>　　生物工程</b></p><p>　　紫色稻生理生化特性研究</p><p>　　1. 課題研究意義及國內外研究現狀</p><p>　　紫葉突變體作為葉

76、色突變體的一種，它的性狀識別明顯，受環(huán)境影響小，遺傳性狀較穩(wěn)定。因此，其在水稻分類、遺傳研究和育種實踐上都有很大的作用。</p><p>　　通過紫葉表型不但可以測定種子純度，還可以在苗期剔除受外源花粉污染的種子和假雜種，并且在良種繁育和雜交育種上有廣闊的應用前景。若能將品質和利用價值結合選育出一種品質優(yōu)良的紫葉突變體，將具有重要意義。</p><p>　　對一些紫葉突變體的基因定位、遺傳

77、及光合生理特性的研究表明，水稻紫色葉突變體的遺傳是由一對或幾對隱性的核基因控制的，且它葉色變紫是逐步的。剛長出的新葉片表現為正常的綠色，隨后從葉尖向下葉色逐漸的變?yōu)樽仙氩康囊脖憩F出相同的葉色變化規(guī)律。</p><p>　　總之，對紫色葉色標記不僅實現了既可簡便、經濟、快速確定種子純度，為種子質量預警，又可在制、繁種標一記輔助去雜，并在生產中能一定程度地自動剔除假雜種，在兩系雜交水稻的生產應用中具有極其廣闊的市

78、場前景。</p><p>　　新選育出來的品種紫色水稻與其它品種的水稻的比較來看，長勢較好，現將其與同樣生長條件下的其他品種水稻的生理生化特性進行比較，比較分析分析得出它各種指標的優(yōu)越性，為紫色水稻繼續(xù)育種提供依據。</p><p>　　2. 課題研究的主要內容、預期目標和研究方案</p><p>　　主要內容：（1）選取不同品種同一生長環(huán)境的水稻整個植株為材料，分

79、別進行不同部位（葉、莖和籽粒）的預備處理。</p><p>　?。?）提取分析4種主要的酶和葉綠素，包括多酚氧化酶、苯丙氨酸解氨酶、過氧化物酶、過氧化氫酶的活性，并對其進行比較，分析不同品種間的差異。</p><p>　?。?）采用各種生化分離技術進行實驗操作如冷凍高速離心法粗提酶，紫外分光光度法對酶的活性的測定。</p><p>　　預期目標：（1）水稻不同品種間

80、理化性質的比較，篩選出紫色水稻長勢優(yōu)越的依據。</p><p><b>　?。?）撰寫畢業(yè)論文</b></p><p><b>　　研究方案：</b></p><p><b>　　3. 課題進度計劃</b></p><p>　　2010年09月至2010年10月：收集相關資料，

81、熟悉實驗步驟</p><p>　　2010年11月至2010年12月：實驗準備，并對樣品進行處理，開展預備實驗；</p><p>　　2011年01月至2011年02月：參照預實驗的實驗結果，開展實驗，比較不同品種水稻的理化特性；</p><p>　　2011年02月至2011年04月：完成實驗資料的整理、論文撰寫與修改。</p><p>&

82、lt;b>　　4. 參考文獻</b></p><p>　　[1] 孔祥生,易現峰.植物生理學實驗技術[M].北京:中國農業(yè)出社,2008:126-131,259-261.</p><p>　　[2] 張志良,瞿偉菁.植物生理學實驗指導[M].北京:高等教育出版社,2003:39-41,277-288.</p><p>　　[3] 陳毓荃.生物化學實

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85、[9] 高曉玲.紫葉水稻突變體PLM的品質研究[J].安徽農業(yè)科學,2010,38(35):19960-19962.</p><p>　　[10] 王海鳳.紫色水稻突變體育種利用研究[D].福建農林大學碩士學位論文,2008.</p><p>　　[11] 蔡漢權,李粉玲.幾種橄欖材料的多酚氧化酶活力[J].亞熱帶農業(yè)研究,2005,1(4):34-37.</p><p

86、>　　[12] 董艷珍.植物苯丙氨酸解氨酶基因的研究進展[J].生物技術通報, 2000,8(4):31-33.</p><p><b>　　畢業(yè)論文文獻綜述</b></p><p><b>　　生物工程</b></p><p>　　水稻葉色突變體研究進展</p><p>　　摘要：葉色突變是

87、比較常見的突變性狀。葉色突變體在基礎研究和育種工作中越來越顯得重要。本文從水稻葉色突變體的產生方法、類型、遺傳規(guī)律、光合特性及應用等方面系統(tǒng)綜述了水稻葉色突變體的研究進展，并對葉色突變體的應前景做了進一步分析。</p><p>　　關鍵詞：水稻；葉色突變體；應用</p><p>　　葉色突變是自然界普遍存在的一種突變，早在20世紀30年代就已在水稻、大豆、大麥、小麥、棉花等多種植物上發(fā)現[

88、1]。</p><p>　　正常葉色是植物長期進化的結果，而葉色變異通常影響突變體光合速率，往往使植物發(fā)育遲緩、競爭力下降，造成作物減產，嚴重時甚至導致植株死亡。過去大量的報道認為葉色突變體在基礎研究中具備一定的意義，但缺乏實際的生產應用價值，因此常被認為是無意義的突變[2]。但隨著技術的發(fā)展，這種過去被認為是無意義的突變，現在已經受到越來越多的關注。</p><p>　　1 葉色突變體產

89、生原因、產生方法及分類</p><p><b>　　1.1 產生的原因</b></p><p>　　根據現有對高等植物葉片呈色原因的研究表明，葉片呈色過程相當復雜，與葉片細胞內色素的種類、含量以及在葉片中的分布有關，是各種色素的綜合表現，其中主要是綠色的葉綠素和黃色的類胡蘿卜素兩大類色素的比例[3]。總的來說，植物的葉色突變主要是葉片中各種色素的分配不同而產生的。&l

90、t;/p><p>　　1.2 葉色突變體的產生方法</p><p>　　葉色突變體的來源十分廣泛，基本上可以分為自然突變、人工誘發(fā)突變兩大類。</p><p>　　自然突變就是指在自然條件下自發(fā)形成的突變，未經復雜的生物技術手段，將其直接用于常規(guī)育種，不會產生安全性問題。但自然突變的頻率極低，可利用率不高。</p><p>　　人工誘發(fā)植物基因突

91、變是創(chuàng)造新種質、選育新品種的主要途徑。人工誘變又分為物理誘變、化學誘變以及基于基因操作技術導致的突變[4]。</p><p>　　物理誘變是指利用電離輻射（X射線、γ射線及紫外線，α及β粒子，質子及中子等）處理水稻種子或幼苗使其產生突變體的一種常規(guī)方法。魏玉波等[5]將日本優(yōu)質、耐冷性水稻品種干種子經50Gy60Co-γ射線處理，在T2代群體中選育出莖葉超綠突變體。</p><p>　　化

92、學誘變法是指利用化學誘變劑處理水稻種子使其誘變產生突變體的一種方法。國際水稻研究所（IRRI）收集了大量由快速中子、γ射線和化學誘變劑誘變產生的突變體[6]，并開始用生物脅迫或非生物脅迫的方法來篩選形態(tài)缺失突變體。Meskauskiene等[7]采用EMS誘變技術得到控制葉綠素合成負調控的flu突變體。</p><p>　　基因操作技術誘變主要是指基因插入突變，主要包括T-DNA插入突變、轉座子插入突變。插入突變

93、最大的優(yōu)點在于，可將插入元件作為標簽從基因組中分離出相應的基因。</p><p>　　T-DNA標簽技術是以農桿菌介導的遺傳轉化為基礎的一種插入突變研究方法。由于農桿菌的寄主范圍較廣，轉化技術成熟，故是創(chuàng)造插入突變體的有效途徑。該法的最大優(yōu)點是產生的突變體穩(wěn)定、拷貝數低以及便于進行遺傳和分子分析。而且，T-DNA的插入熱點多集中在基因組的活躍轉錄或具有轉錄潛力的區(qū)域，是理想的基因標記工具[8]。</p>

94、;<p>　　轉座子（transposon）是染色體上一段可移動的DNA片段，可從染色體的一個位置跳到另一個位置[9]。當轉座子跳躍而插入到某個功能基因時，就會引起該基因的失活，并誘導產生突變型[8]。</p><p>　　1.3 葉色突變體的分類</p><p>　　水稻葉色突變體的主要特點是葉色表型發(fā)生了變異，突變成不正常的綠色，易于觀察，它的突變主要發(fā)生在苗期，根據突變

95、體苗期的葉色表型加以分類可分為白化（albina）、黃化（xanthan）、淺綠（virids）、條紋（striata）、斑點（tigrina）5大主要類型。另外Awan等則將葉色突變體細分為白化、黃化、淺綠、綠白、白翠、黃綠、綠黃和條紋8種類型[10]。根據溫度對葉色標記表達的影響，吳殿星等將8個溫敏核不育系葉色突變體分為高溫表達型，低溫表達型和溫鈍型3種[11]。</p><p>　　然而苗期的葉色突變一般以

96、植株的表型作為分類依據，具有一定的局限性，因為植物的表型與植物內部的遺傳性質并不一定是一一對應的，同一表型并不是由同一基因突變引起的，同一基因的突變不一定會引起植株表現出同一表型，還有一些突變性狀在苗期不表達。根據很多研究表明僅僅以突變體的葉子顏色來分類，很可能會不利于基因生物功能的研究。隨著葉色突變類型的逐漸增多，實際應用中常結合多種分類方法對其進行科學的分類。</p><p>　　2 水稻葉色突變體的遺傳研究

97、</p><p>　　葉色突變的種類繁多，不同突變體之間的差異很大。葉色突變有可能是數量性狀，也有可能是質量性狀。有可能是細胞核遺傳，也有可能是細胞質遺傳。</p><p>　　水稻葉色突變受細胞核和細胞質2類不同遺傳體系的控制。大多數研究表明，水稻葉色突變性狀多受1對隱性核基因控制。水稻葉色突變基因在染色體上的分布比較廣泛。目前，第1-8、10及11號染色體上都發(fā)現了葉色突變基因[12-

98、13]。張力科等[14]對兩個新的水稻葉色突變體形態(tài)結構與遺傳定位研究中，通過對各雜交組合的F1和F2群體的葉色分離情況進行統(tǒng)計分析，表明白色條紋性狀是由1對隱性的核基因控制，了黃色突變性狀也是由1對隱性核基因控制，且與控制白色條紋性狀的基因不等位。吳關庭等[15]對PLM12紫葉突變體的研究也表明，水稻葉色突變體受單隱性核基因遺傳控制。</p><p>　　植株的葉綠體變異受內部基因和外部環(huán)境的共同作用。外部環(huán)

99、境對葉綠體變異的影響研究最多的是溫度對葉綠體變異的影響。劉貴富等用輻射誘變的水稻葉色突變體中。發(fā)現有4個突變體的葉色表達與溫度有關。突變體W17和W25在低溫條件下（20-25℃）葉片表現在白色，在高溫條件下（30-35℃）葉片轉化為淺綠色；相反，突變體W4和W11在高溫條件下（30-35℃）葉片呈白色，在低溫條件下（20-25℃）葉片表現為黃色或淺黃色（劉貴富等，1996；趙海軍等，2004）。</p><p>

100、;　　3 水稻葉色突變體的光合特性</p><p>　　目前對于水稻葉綠素缺失突變體的光合特性研究也比較多，結果也不盡相同。己有研究表明，葉綠素缺乏會引起光能吸收的下降，葉色突變體許多因為Rubisco酶等酶活性下降或失活影響光合能力但也有報道突變體表現出較好的光合性能。龔紅兵等[16]對水稻鎮(zhèn)恢249葉綠素缺失突變體的遺傳分析表明，與鎮(zhèn)恢249相比，突變體的葉綠素含量降低，光合速率降低。胡忠等[17]在研究水稻

101、黃綠色突變體的光合特性時的結果表明，葉綠體基粒結構與捕光葉綠素確蛋白含量成正相關，它并非為光合作用基本過程所必需。張玉麟等[18]經研究發(fā)現除水稻白化苗植株體內有游離葉綠素存在外，所有高等植物中葉綠素都是與蛋白質結合在一起的，并以葉綠素蛋白質復合體的形式存在和行使功能。</p><p>　　4 水稻葉色突變體的應用</p><p>　　近年來，隨著分子生物學、基因組學和生物學研究的不斷深入

102、，水稻葉色突變體的利用價值愈加受到重視，其不但可以進行植物生理、基因功能等基礎研究，而且在實際生產中也有很大的應用潛力。</p><p>　　4.1 葉色標記在水稻雜交育種中的應用</p><p>　　在雜交水稻生產過程中，由于不育系的育性不穩(wěn)定而嚴重影響雜交種子或是親本的純度，給農業(yè)生產帶來重大損失。利用葉色標記將易于識別的葉色標記性狀轉育到水稻三系或兩系不育系上，從而根據葉色標記可以在

103、苗期便捷的去除雜株，保證種子的純度。</p><p>　　因此，開展水稻葉色突變體理論與應用研究，對于提高雜交稻生產的田間純度具有重要意義。</p><p>　　4.2 葉色突變體在植物激素生理中的應用</p><p>　　激素含量與葉色間有著較為密切的聯(lián)系。因為葉色突變體的突變基因可直接或間接影響激素的合成，所以鑒定缺失激素的葉色突變體，不但可以增強對激素合成途徑

104、的了解，而且可以克隆出參與激素生物合成的基因[19]。水稻植株ABA（脫落酸）生物合成途徑中的基因突變，可直接抑制ABA的合成，從而影響突變體的生長發(fā)育，造成葉色突變。葉片介于灰綠和綠色之間，Agrawal等[20]通過正向遺傳學的方法從中分離出了1個參與ABA生物合成的基因。</p><p>　　植物激素影響葉片的顏色，也影響植物體的生長、成熟和衰老。缺乏ABA的葉色突變體則通常表現出下列性狀:過早萌發(fā)、易于萎

105、蔫及可在高滲培養(yǎng)基上萌發(fā)和生長等[19]。</p><p>　　4.3 葉色突變體在品種改良中的應用</p><p>　　培育高光效水稻是實現水稻增產的重要途徑之一。葉綠素是光合作用的必要條件，常綠突變體因為葉綠素降解途徑受到阻礙，可以延緩葉片衰老，所以功能型常綠突變體的葉片在生育后期葉綠素含量和光合能力保持不變[21]，若將常綠突變基因導入正常植株，則可以延長植株光合作用時間，進而提高光

106、合效率，最終達到增產的目的。如Gan和Amasino曾用轉基因技術誘發(fā)了1個煙草常綠突變體，此種突變體的生物量和種子產量分別增加了40%和52%[22]。</p><p>　　4.4 葉色突變體在功能基因組學研究中的應用</p><p>　　葉色突變體可以導致控制葉綠素生物合成和葉綠體發(fā)育的重要基因的沉默或失活[23]。通過對葉色突變體基因的研究，將多個控制葉綠素合成和發(fā)育的基因從缺失色素

107、的葉色突變體中分離鑒定出來，因此葉色突變體是研究葉綠體結構、功能的理想材料。</p><p>　　葉色突變體可用于研究單個基因的功能，也可用于研究基因間的互作?？捎糜谌~綠體、線粒體、細胞核之間遺傳分子信號的傳導追蹤及他們之間的協(xié)同作用。</p><p><b>　　5 展望</b></p><p>　　綜上所述，葉綠素突變作為一種明顯的性狀突變

108、，不僅容易被識別也容易獲得。盡管人們很早就進行這方面的研究，但在實際生產中卻未能充分利用，相信，隨著對植物葉色突變發(fā)生機制的深入了解，植物生理學研究手段的不斷發(fā)展，以及分子生物學、功能基因組學和生物信息學研究的不斷深入，對葉色突變體的應用研究將不斷取得新的突破。</p><p><b>　　參考文獻</b></p><p>　　[1] 苗晗,顧興芳,張圣平等.蔬菜葉色

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