山羊白細胞介素-1β與白細胞介素-6的克隆表達及生物學(xué)活性研究.pdf

1、白細胞介素-1β（IL-1β）是一種在動物機體的炎癥發(fā)生中起重要調(diào)節(jié)作用的細胞因子，主要由單核/巨噬細胞合成和分泌，通過誘導(dǎo)淋巴細胞的分化和增值提高機體細胞免疫應(yīng)答。IL-1β還可以提高疫苗的免疫效果，作為潛在的免疫佐劑。將IL-1β作為疫苗佐劑已經(jīng)在綿羊、豬、牛和魚等動物中廣泛研究或使用。
　　 白細胞介素-6（IL-6）是一種多功效的細胞因子，其在調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答、急性期反應(yīng)、造血功能以及炎癥反應(yīng)中發(fā)揮著重要的作用。機體許多細胞

2、都可以合成和分泌IL-6，并且作用于B細胞、T細胞、肝實質(zhì)細胞、骨髓造血干細胞以及中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的某些細胞。IL-6和IL-1、TNF-α共同作用是機體急性期反應(yīng)發(fā)生的強有力的誘發(fā)因子。
　　 本研究根據(jù)山羊IL-1β（GenBank登錄號D63351）和山羊IL-6（GenBank登錄號D86569），設(shè)計并合成特異性引物，分別以本實驗室保存的山羊IL-1βcDNA和IL-6 cDNA為模板，擴增了山羊IL-1β和IL-6的全

3、序列和成熟肽序列基因。結(jié)果顯示，山羊IL-1β開放閱讀框(ORF)為801bp，與CenBank中登錄的山羊IL-1β基因序列（登錄號D63351）相似性為99.4％，編碼267個氨基酸。山羊IL-6開放閱讀框(ORF)為627bp，切除信號肽后核苷酸片段大小為552bp，與GenBank中登錄的山羊IL-6基因序列（登錄號D86569）相似性為99.6％，編碼184個氨基酸。
　　 應(yīng)用DNA重組技術(shù)，將克隆成功的山羊GIL-

4、1β基因和mGIL-6成熟蛋白基因分別與原核表達載體pET-28a(+)和pET-32a(+)連接，構(gòu)建了pET-28a(+)-GIL-1β和pET-32a(+)-mGIL-6原核表達載體。將其轉(zhuǎn)化至E.coli BL21(DE3)宿主菌中誘導(dǎo)表達，表達產(chǎn)物超聲裂解后經(jīng)SDS-PAGE分析，GIL-1β融合蛋白大小為33.07KDa，mGIL-6融合蛋白大小為42.24KDa。GIL-1β融合蛋白主要以包涵體形式存在，mGIL-6融合蛋

5、白則以上清和包涵體兩種形式存在。用His鎳柱將其成功純化后，并對溶解在尿素中的GIL-Iβ包涵體采用透析復(fù)性法將其復(fù)性。
　　 為了檢測GIL-1β融合蛋白和mGIL-6融合蛋白的生物學(xué)活性，本實驗通過GIL-1β融合蛋白協(xié)同伴刀豆蛋白A(ConA)促C57BL品系小鼠胸腺細胞增值實驗檢測了GIL-Iβ融合蛋白的活性，結(jié)果顯示重組山羊IL-1β具有明顯促C57BL品系小鼠胸腺細胞增值效應(yīng)。通過mGIL-6融合蛋白對伴刀豆蛋白A(