雜交育種與基因工程

1、,提高突變率，加快育種進(jìn)程，大幅改良性狀,用物理、化學(xué)或生物方法處理生物,誘變育種,操作復(fù)雜，難度大,提取，結(jié)合，導(dǎo)入，檢測(cè)與表達(dá),基因工程育種,,,多倍體育種,發(fā)育緩慢、生長(zhǎng)期長(zhǎng)、結(jié)實(shí)率低,明顯縮短育種年限,單倍體育種,基因重組,雜交育種,缺 點(diǎn),優(yōu) 點(diǎn),方 法,原 理,名稱,,,,,,,,,,,,,,雜交→自交→連續(xù)自交選優(yōu),,基因突變,具有不定向性，有利變異少，需處理大量的材料,將不同個(gè)體的優(yōu)良性狀集中于一個(gè)體上,花藥離體培

2、養(yǎng)，再秋水仙素處理使染色體加倍,目的性強(qiáng)，能定向改造生物,染色體變異,秋水仙素處理萌發(fā)的種子或幼苗,需與雜交育種配合，多限于植物,染色體變異,莖稈粗壯，營(yíng)養(yǎng)豐富,基因重組,育種周期長(zhǎng)，工作量大,,,,,,考點(diǎn)37：生物變異在育種上應(yīng)用（Ⅱ）,植物細(xì)胞全能性和細(xì)胞膜流動(dòng)性,去壁－原生質(zhì)體融合－雜種細(xì)胞－組織培養(yǎng)－雜種植株,克服了遠(yuǎn)緣雜交不親和的障礙,雜種植株還不能按照人們需要表現(xiàn)出兩親代的優(yōu)良性狀,植物體細(xì)胞雜交,動(dòng)物細(xì)胞核移植（克?。?/p>

3、,動(dòng)物體細(xì)胞核的全能性,將具備所需性狀的體細(xì)胞核移植到去核卵細(xì)胞中－重組細(xì)胞－激活－重組胚胎－胚胎移植－新個(gè)體,改良動(dòng)物品種，拯救瀕危動(dòng)物,難度大,成活率低,利用植物激素進(jìn)行育種,適宜濃度的生長(zhǎng)素可以促進(jìn)果實(shí)的發(fā)育,在未受粉的雌蕊柱頭上涂抹一定濃度的生長(zhǎng)素類似物溶液，促進(jìn)子房壁發(fā)育成無(wú)子果實(shí),可得到無(wú)子果實(shí),該變異類型是不遺傳的,,,,,,,通常從F2開(kāi)始選種，因?yàn)閺腇2開(kāi)始發(fā)生性狀分離,實(shí)例：用輻射方法培育“黑農(nóng)五號(hào)”大豆品種用X

4、射線、紫外線照射等方法培育高產(chǎn)青霉菌株太空育種（利用宇宙射線進(jìn)行空間誘變育種）,,單倍體育種過(guò)程,,,1．為什么以一定濃度的秋水仙素溶液滴在二倍體西瓜幼苗的芽尖?,西瓜幼苗的芽尖有絲分裂旺盛，用秋水仙素處理有利于抑制紡錘體的形成，從而形成四倍體植株。,2、為什么三倍體高度不育？,奇數(shù)的同源染色體不能正常聯(lián)會(huì)，所以形成有一個(gè)完整的染色體組的配子的機(jī)率很低。,3、為什么還要給三倍體植株授粉？,為了獲得生長(zhǎng)素，刺激子房發(fā)育,4、三倍體生長(zhǎng)發(fā)

5、育慢，且高度不育，如何留種、擴(kuò)大生產(chǎn)？,組織培養(yǎng)、營(yíng)養(yǎng)繁殖,,,基因工程的概念,限制性核酸內(nèi)切酶,1.來(lái)源：主要是從 中分離純化出來(lái)的。2.功能：能夠識(shí)別雙鏈DNA分子的某種 核苷酸序列，并且使每一條鏈中 部位的兩個(gè)核苷酸之間的 斷開(kāi)，因此具有 性。,特定,原核生物,特定,磷酸二酯鍵,特異,作

6、用結(jié)果：,產(chǎn)生黏性末端或平末端,,,G A A T T C,限制酶切割DNA分子示意圖,,,,,,,,,C T T A A G,,,,,,,黏性末端,EcoRⅠ,,C C C G G G,限制酶切割DNA分子示意圖,,,,,,,,,G G G C C C,,,,,,,平末端,SmaⅠ,,,限制酶只能作用于DNA，不能作用于RNA,不同的限制酶也可能切割得到

7、相同的黏性末端,切割目的基因和運(yùn)載體時(shí)通常要求使用同一種限制酶,1。分類： 根據(jù)酶的來(lái)源不同，可分為兩類：一類是從 中分離得到的，稱為 連接酶；另一類是從 中分離出來(lái)的，稱為 連接酶。,基因的的針線——DNA連接酶,大腸桿菌,E.coliDN

8、A,T4噬菌體,T4DNA,2。兩種DNA連接酶的比較：（1）相同點(diǎn)：都縫合 鍵。（2）區(qū)別：E·coliDNA連接酶只能將雙鏈DNA片段互補(bǔ)的 之間連接起來(lái)，而不能將雙鏈DNA片段 之間進(jìn)行連接；而T4DNA連接酶既可以“縫合”雙鏈DNA片段互補(bǔ)的 ，又可以“縫合”雙鏈DNA片段的

9、 。但連接平末端的之間的效率較 。,磷酸二酯,黏性末端,平末端,黏性末端,平末端,低,（3）連接的部位： 磷酸二酯鍵（在“梯子”的扶手處）， 不是氫鍵（在“梯子”的踏板處）。,運(yùn)載體有哪些？應(yīng)具備什么特點(diǎn)？,常用的運(yùn)載體主要有兩類： 1）質(zhì)粒 2）噬菌體衍生物或某些動(dòng)植物病毒,來(lái)源：細(xì)菌及酵母菌等生物本質(zhì)：小型環(huán)狀DNA分子特點(diǎn)：結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、能自我復(fù)制、有一個(gè)至多個(gè)限制酶切點(diǎn)

10、、具有標(biāo)記基因,基因工程的操作流程：,目的基因,運(yùn)載體,,,,重組DNA,,受體細(xì)胞,,轉(zhuǎn)基因生物,（1）目的基因的獲?。?）基因表達(dá)載體的構(gòu)建（3）將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞（4）目的基因的檢測(cè)與鑒定,如何獲取目的基因？,獲取目的基因的方法有：①?gòu)淖匀唤缫延械奈锓N中分離出來(lái)②通過(guò)DNA合成儀用化學(xué)方法人工合成③從基因文庫(kù)中獲?、芾肞CR技術(shù)擴(kuò)增目的基因⑤反轉(zhuǎn)錄法合成,,基因文庫(kù)：含有不同基因的受體菌群。包括基因組文庫(kù)和c

11、DNA文庫(kù)。,,條件：引物、模板、dNTP、Taq酶、緩沖液過(guò)程：高溫變性、低溫復(fù)性、適溫延伸,RNA → DNA,逆轉(zhuǎn)錄酶,1.什么是基因文庫(kù)？,種類,,基因組文庫(kù)：,cDNA文庫(kù)：,含有一種生物的全部基因,含有一種生物的部分基因,（1）從基因文庫(kù)中獲取目的基因,將含有某種生物不同基因的許多DNA片斷，導(dǎo)入到受體菌的群體中，各個(gè)受體菌分別含有這種生物的不同基因，稱為基因文庫(kù)。,,PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因的過(guò)程：,PCR技術(shù)擴(kuò)增過(guò)程

12、,a、DNA變性（90℃-95℃）：雙鏈DNA模板 在熱作用下， 斷裂，形成__　　____,b、復(fù)性（55℃-60℃）：系統(tǒng)溫度降低，引物 與DNA模板結(jié)合，形成局部________。,c、延伸（70℃-75℃）：在Taq酶的作用下，從引物的5′端→3′端延伸，合成與模板互補(bǔ)的________。,氫鍵,單鏈DNA,雙鏈,DNA鏈,（二）基因表達(dá)載體的構(gòu)建,——核心,,質(zhì)粒,DNA分子,,限制酶處理,,,兩個(gè)切

13、口獲得目的基因,DNA連接酶,重組DNA分子（重組質(zhì)粒）,,同一種,一個(gè)切口兩個(gè)黏性末端,復(fù)制原點(diǎn)+目的基因+啟動(dòng)子+終止子+標(biāo)記基因,基因表達(dá)載體的組成包括哪些部分？,①?gòu)?fù)制是從DNA分子上的特定位置開(kāi)始的,這一位置叫復(fù)制原點(diǎn),②啟動(dòng)子是基因的一個(gè)組成部分，是RNA聚合酶特異性識(shí)別和結(jié)合的DNA序列,③終止子是 DNA分子中終止轉(zhuǎn)錄的核苷酸序列,將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞的方法有哪些？,,將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞,將目的基因?qū)雱?dòng)物

14、細(xì)胞,將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞,,農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法,基因槍法,花粉管通道法,——顯微注射法,——感受態(tài)細(xì)胞（Ca2+處理法）,農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法,農(nóng)桿菌：生活在土壤中。能在自然條件下感染雙子葉植物和裸子植物，而對(duì)大多數(shù)單子葉植物無(wú)感染能力。,過(guò)程：,構(gòu)建表達(dá)載體（重組Ti質(zhì)粒）,將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞之,顯微注射技術(shù),2.將目的基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞之,將含有目的基因的表達(dá)載體提純(濃度1-3%ug/mL),取卵,,顯微注射,人工受精,,將受精卵移入

15、子宮,,感受態(tài)細(xì)胞,3、將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞：,(A)常用的受體細(xì)胞：,大腸桿菌(最廣泛)、枯草桿菌、土壤農(nóng)桿菌,(B)導(dǎo)入途徑：,受體細(xì)胞(細(xì)菌),主要是借鑒細(xì)菌或病毒侵染細(xì)胞方法,原因：繁殖快，單細(xì)胞，遺傳物質(zhì)少。,（-4℃）,因?yàn)榇竽c桿菌等細(xì)菌的細(xì)胞壁成分主要是肽聚糖，因此一般要先用Ca2＋ 處理，以增加細(xì)菌細(xì)胞壁的通透性。,思考：為什么要用Ca2＋處理細(xì)胞？,分子水平的檢測(cè),個(gè)體水平鑒定——,,①檢測(cè)轉(zhuǎn)基因生物染色體的DN

16、A 上是否插入了目的基因,②檢測(cè)目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA,③檢測(cè)目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì),抗蟲(chóng)鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等,——DNA分子雜交技術(shù),——分子雜交技術(shù),—— 抗原—抗體雜交,8、如何進(jìn)行目的基因的檢測(cè)和鑒定？,給蟲(chóng)喂食轉(zhuǎn)基因植物的葉片，觀察蟲(chóng)是否死亡,用相應(yīng)的病菌感染轉(zhuǎn)基因生物，觀察該個(gè)體是否感病,將轉(zhuǎn)基因生物培養(yǎng)在相應(yīng)的環(huán)境中，觀察個(gè)體是否存活,（觀察雜交后是否出現(xiàn)雜交帶）,9、（DNA）分子雜交技術(shù)的原理是什

17、么？,——堿基互補(bǔ)配對(duì)原則,原理,,,基因治療：,把正?；?qū)氩∪梭w內(nèi)，使該基因的表達(dá)產(chǎn)物發(fā)揮功能，從而達(dá)到治療的目的。,（導(dǎo)入外源基因后，病人體內(nèi)的缺陷基因仍然存在）,基因診斷（檢測(cè)）：,運(yùn)用基因工程設(shè)計(jì)制造的“DNA探針”檢測(cè)病毒感染及遺傳缺陷。,,,10、舉例說(shuō)明轉(zhuǎn)基因植物的生產(chǎn)流程（如抗蟲(chóng)棉的培育）,（蘇云金桿菌）抗蟲(chóng)基因,（農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒）T-DNA,,,,重組質(zhì)粒,,農(nóng)桿菌,,導(dǎo)入,導(dǎo)入,DNA連接酶,（雙子葉、裸子植物）

18、組織細(xì)胞,,基因工程,,脫分化,愈傷組織,,再分化,胚狀體,,轉(zhuǎn)基因植物,,植物組織培養(yǎng)技術(shù),含有外源基因的植物可看做是雜合子，通過(guò)雜交、自交等手段可獲得純合的轉(zhuǎn)基因植物,11、舉例說(shuō)明轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的生產(chǎn)流程（如利用轉(zhuǎn)基因動(dòng)物生產(chǎn)藥物）,藥用蛋白基因,乳腺蛋白基因的啟動(dòng)子等調(diào)控組件,,,,基因表達(dá)載體,,顯微注射法,受精卵,,基因工程,,早期胚胎,體外胚胎培養(yǎng),,胚胎移植,代孕母體,,轉(zhuǎn)基因動(dòng)物,,胚胎工程,,雌性動(dòng)物分泌的乳汁中含有藥用

19、蛋白,乳腺生物反應(yīng)器,12、舉例說(shuō)明轉(zhuǎn)基因工程菌的生產(chǎn)流程（如利用大腸桿菌生產(chǎn)人的胰島素）,（1）常選擇大腸桿菌等原核生物作為基因工程受體細(xì)胞的原因：,繁殖快、多為單細(xì)胞、遺傳物質(zhì)相對(duì)較少,（2）過(guò)程：,人的胰島素基因,細(xì)菌質(zhì)粒,,,,重組質(zhì)粒,Ca2+,,大腸桿菌,,細(xì)胞壁的通透性增大（感受態(tài)細(xì)胞）,,重組質(zhì)粒與感受態(tài)細(xì)胞混合，并促進(jìn)感受態(tài)細(xì)胞吸收DNA分子,,目的基因隨受體細(xì)胞的繁殖而復(fù)制,在大腸桿菌中合成的人的胰島素沒(méi)有活性，需經(jīng)

20、過(guò)加工、激活。,蛋白質(zhì)工程是指以蛋白質(zhì)分子的結(jié)構(gòu)規(guī)律及其與生物功能的關(guān)系作為基 礎(chǔ)，通過(guò)基因修飾或基因合成，對(duì)現(xiàn)有蛋白質(zhì)進(jìn)行改造或制造一種新的蛋白質(zhì)，以滿足人類對(duì)生產(chǎn)和生活的需求。,1.概念：,第二代基因工程——蛋白質(zhì)工程,2.基本原理 ： 確定蛋白質(zhì)的功能,→蛋白質(zhì)應(yīng)有的高級(jí)結(jié)構(gòu),→蛋白質(zhì)應(yīng)具備的折疊狀態(tài),→應(yīng)有的氨基酸序列,→應(yīng)有的堿基排列,→創(chuàng)造自然界不存在的蛋白質(zhì)。,3.蛋白質(zhì)工程的前提條件：,4.蛋白質(zhì)工程的關(guān)鍵技術(shù)：,了

21、解蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能的關(guān)系,基因工程,5.蛋白質(zhì)工程的目的：,定向改造天然蛋白質(zhì)，創(chuàng)造自然界不存在的蛋白質(zhì),6.蛋白質(zhì)工程的實(shí)質(zhì)：,對(duì)編碼蛋白質(zhì)的基因進(jìn)行改造,,細(xì)胞工程,指應(yīng)用細(xì)胞生物學(xué)和分子生物學(xué)的原理和方法，通過(guò)某種工程學(xué)手段，在細(xì)胞整體水平或細(xì)胞器水平上，按照人們的意愿來(lái)改變細(xì)胞內(nèi)的遺傳物質(zhì)或獲得細(xì)胞產(chǎn)品的一門綜合科學(xué)技術(shù)。,細(xì)胞工程,植物細(xì)胞工程,,,植物組織培養(yǎng),植物體細(xì)胞雜交,動(dòng)物細(xì)胞工程,植物組織培養(yǎng)的概念：,在無(wú)菌和人

22、工控制的條件下將離體的植物器官、組織、細(xì)胞，培養(yǎng)在人工配制的培養(yǎng)基上，給予一定的培養(yǎng)條件，誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織和胚狀體，最終形成完整的植株。,脫分化,再分化,一、植物組織培養(yǎng),（分化）,條件？,①適宜溫度、pH和無(wú)菌環(huán)境、 無(wú)光。②無(wú)機(jī)物、有機(jī)物和植物激素（生長(zhǎng)素，細(xì)胞分裂素等），瓊脂,無(wú)定形狀態(tài)薄壁細(xì)胞高度液泡化排列疏松、無(wú)規(guī)則無(wú)葉綠體,不進(jìn)行光合作用,分化程度低脫分化較易,理論基礎(chǔ)：,細(xì)胞的全能性,植物組織培養(yǎng)的培養(yǎng)基,無(wú)機(jī)營(yíng)

23、養(yǎng)成分：無(wú)機(jī)鹽離子有機(jī)營(yíng)養(yǎng)成分： ① 含N物質(zhì)：包括維生素和氨基酸 ② 碳源：2%—5%的蔗糖溶液，調(diào)節(jié)滲透壓 ③ 瓊脂：起支持作用 ④ 激素：生長(zhǎng)素，細(xì)胞分裂素和赤霉素PH值：5.0－6.0,,細(xì)胞的全能性,1. 概念:,已高度分化的細(xì)胞仍具有發(fā)育成完整個(gè)體的潛能。,2. 原因：,生物體細(xì)胞含有本物種所特有的全套遺傳信息。,3. 全能性高低：,①受精卵＞胚胎干細(xì)胞＞生殖細(xì)胞＞體細(xì)胞②植物細(xì)胞＞動(dòng)物細(xì)胞,,1、植物

24、細(xì)胞表現(xiàn)出全能性的條件有哪些？2、在植物組織培養(yǎng)過(guò)程中，為什么要進(jìn)行一系列的消毒，滅菌，并且要求無(wú)菌操作？3、為什么切取胡蘿卜根的形成層，其他部分也能培養(yǎng)成小植株嗎？,細(xì)胞離體、一定的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、激素和其他外界條件。,避免雜菌在上面迅速生長(zhǎng)消耗營(yíng)養(yǎng)，且有些雜菌會(huì)危害培養(yǎng)物的生長(zhǎng)。,想一想,形成層更容易誘導(dǎo)成愈傷組織，其他部分如葉、花也能培養(yǎng)成小植株，只是稍微困難些。,4、脫分化和再分化對(duì)光照有什么要求？為什么？5、決定植

25、物脫分化、再分化的關(guān)鍵因素是什么？6、請(qǐng)同學(xué)們根據(jù)上述過(guò)程概括出植物組織培養(yǎng) 技術(shù)的流程圖，并與同學(xué)交流。,脫分化避光，因?yàn)楸芄飧仔纬捎鷤M織。再分化需要光照來(lái)合成葉綠素。,植物激素。,當(dāng)生長(zhǎng)素含量高于細(xì)胞分裂素時(shí)，有利于根的形成。,當(dāng)生長(zhǎng)素含量低于細(xì)胞分裂素時(shí)，有利于芽的形成。,1、定義：,將兩個(gè)來(lái)自不同植物的體細(xì)胞融合成一個(gè)雜種細(xì)胞，且把雜種細(xì)胞培育成新的植物體的過(guò)程。,2、優(yōu)勢(shì)：,克服了遠(yuǎn)緣雜交不親和的

26、障礙，拓展了可用于雜交的親本組合范圍,植物體細(xì)胞雜交,(2),(3),(4),(5),植物體細(xì)胞雜交過(guò)程示意圖,標(biāo)志,,去壁,,你認(rèn)為兩個(gè)來(lái)自不同植物的體細(xì)胞完成融合，遇到的第一個(gè)障礙是什么？,細(xì)胞壁,有沒(méi)有一種溫和的去壁方法呢？,酶解法（用纖維素酶和果膠酶）,原生質(zhì)體如何融合的呢？,人工誘導(dǎo)原生質(zhì)體融合的方法有物理法和化學(xué)法兩大類：物理法是利用離心、振動(dòng)、電刺激等促使原生質(zhì)體融合；化學(xué)法是用聚乙二醇(PEG)等試劑作為誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)融合

27、。,如何將雜種細(xì)胞培育成雜種植株？,如果兩個(gè)來(lái)源不同的原生質(zhì)體發(fā)生了融合，下一部該做何處理？,應(yīng)該誘導(dǎo)其再生壁,（融合完成的標(biāo)志）,植物組織培養(yǎng),,雜種細(xì)胞,（AABB）,去壁,（AABB）,植物體細(xì)胞雜交（細(xì)胞工程育種）,纖維素酶、果膠酶,,促融,,,物理法：離心、振動(dòng)、電刺激,化學(xué)法：PEG（聚乙二醇）,原生質(zhì)體,融合完成標(biāo)記：再生細(xì)胞壁,雜種植株的染色體數(shù)是兩親本細(xì)胞染色體之和,脫分化,再分化,雜種植株分析：(1)雜種植株的特征

28、：具備兩種植物的遺傳特征。原因是雜種植株中含有兩種植物的遺傳物質(zhì)。(2)雜種植株的染色體組成和基因型：①分析方法：體細(xì)胞雜交即兩個(gè)細(xì)胞融合成一個(gè)細(xì)胞，不管染色體、基因組還是染色體組都采用直接相加的方法。②實(shí)例：若一植物細(xì)胞含有2X條染色體，2個(gè)染色體組，基因型為Aabb，另一植物細(xì)胞含有2Y條染色體，2個(gè)染色體組，基因型為ccDd，則新植株應(yīng)為四倍體，其體細(xì)胞中染色體數(shù)為2X+2Y，基因型為AabbccDd。,甲 

29、15; 乙（2n=20 ） （2n=20),,植物體細(xì)胞雜交技術(shù),丙（4n=40）,可育的四倍體,,細(xì)胞中有4個(gè)染色體組，其中2個(gè)來(lái)自甲，2個(gè)來(lái)自乙，可分別形成同源染色體，進(jìn)行正常減數(shù)分裂。稱為異源四倍體，可育。,白菜 × 甘藍(lán)（2n=20） （2n=20),,,配子：,n=10,n=10,,,,n+n=20（細(xì)胞中有2個(gè)染色體組，但不同源，不可育）,,秋水仙素處理,2n+2n=40（細(xì)胞中有4

30、個(gè)染色體組，形成異源四倍體，可育）,植物細(xì)胞工程的實(shí)際應(yīng)用,【速記卡片】1.植物組織培養(yǎng)：(1)條件：離體組織、器官或細(xì)胞(外植體)、適宜的營(yíng)養(yǎng)、植物激素。(2)原理：細(xì)胞全能性。(3)過(guò)程：脫分化、再分化。(4)結(jié)果：得到個(gè)體或細(xì)胞產(chǎn)物。,2.植物體細(xì)胞雜交：(1)原理：細(xì)胞膜的流動(dòng)性、細(xì)胞全能性。(2)過(guò)程：去細(xì)胞壁、融合、植物組織培養(yǎng)。(3)融合方法：物理法(離心、振動(dòng)、電激等)、化學(xué)法(聚乙二醇等)。(4)結(jié)果

31、：雜種植株。(5)意義：克服了遠(yuǎn)緣雜交的不親和的障礙。,動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng),動(dòng)物細(xì)胞融合,單克隆抗體制備,細(xì)胞核移植,動(dòng)物細(xì)胞工程技術(shù),,,,,動(dòng)物細(xì)胞工程的基礎(chǔ),一、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng),概念:就是從動(dòng)物機(jī)體中取出相關(guān)的組織,將它分散成單個(gè)細(xì)胞，然后,放在適宜的培養(yǎng)基中,讓這些細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖。,,一、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng),選材：,動(dòng)物胚胎或幼齡動(dòng)物的組織、器官，它們細(xì)胞增殖能力強(qiáng)，分裂旺盛，分化程度低，容易培養(yǎng)。,在進(jìn)行動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)，用胰蛋白酶或膠原蛋

32、白酶分散細(xì)胞，說(shuō)明細(xì)胞間的物質(zhì)主要是蛋白質(zhì)。動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)適宜的pH為7.2—7.4，此環(huán)境下胃蛋白酶（2.0）沒(méi)有活性，而胰蛋白酶(7.2-8.4)的活性較高。,分散成單個(gè)細(xì)胞,細(xì)胞貼壁： 懸液中分散的細(xì)胞很快就貼附在瓶壁上，稱為細(xì)胞貼壁。 要求：培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿的內(nèi)表面光滑、無(wú)毒、易于貼附。 細(xì)胞的接觸抑制： 當(dāng)貼壁細(xì)胞分裂生長(zhǎng)到表面相互接觸時(shí)，細(xì)胞就會(huì)停止分裂增殖，這種現(xiàn)象稱為細(xì)胞的接觸抑制。

33、,動(dòng)物細(xì)胞生長(zhǎng)特性：,一、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng),動(dòng)物機(jī)體組織,單個(gè)細(xì)胞,原代培養(yǎng),,稀釋,分裝,傳代培養(yǎng),,培養(yǎng)過(guò)程：,原代培養(yǎng),培養(yǎng)過(guò)程：,動(dòng)物胚胎或幼齡動(dòng)物的組織、器官,,細(xì)胞懸浮液,胰蛋白酶,,10代細(xì)胞,原代培養(yǎng),傳代培養(yǎng),,無(wú)限傳代,,單個(gè)細(xì)胞,,加培養(yǎng)液,動(dòng)物組織細(xì)胞間隙中含有一定量的彈性纖維等蛋白質(zhì)，將細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)起來(lái)形成具有一定彈性和韌性的組織和器官。,（分解彈性纖維）,動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)不能最終培養(yǎng)成生物體,1、植物組織培養(yǎng)過(guò)程將組織

34、分散成單個(gè)細(xì)胞的嗎？,２、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程將組織分散成單個(gè)細(xì)胞的嗎？,３、為何動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程將組織分散成單個(gè)細(xì)胞的呢？,４、如何將動(dòng)物組織分散成單個(gè)的細(xì)胞呢？,沒(méi)有,是,成塊的組織細(xì)胞靠在一起,彼此限制了細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖,先用剪刀剪碎,后用蛋白酶處理。,思考題,６、細(xì)胞膜的主要成份是什么？,,７、胰蛋白酶能將細(xì)胞消化掉嗎？,８、既然胰蛋白酶能將細(xì)胞消化掉，那將動(dòng)物組織分散成單個(gè)細(xì)胞要注意什么問(wèn)題呢？,蛋白質(zhì)和磷脂,能,注意時(shí)間的控制,

35、思考題,５、胰蛋白酶的作用是什么呢？由此可說(shuō)明細(xì)胞間的物質(zhì)是什么成份？,胰蛋白酶水解蛋白質(zhì),細(xì)胞間的成份是蛋白質(zhì),,９、能夠用胃蛋白酶代替胰蛋白酶嗎？為什么？,,１０、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)取材時(shí)，一般是取胚胎組織或幼齡動(dòng)物的組織或器官，請(qǐng)解釋原因？,不能，因?yàn)閮烧叩淖钸mpH不同，而正常組織細(xì)胞的生存環(huán)境與胰蛋白酶的最適pH較接近,胚胎組織或幼齡動(dòng)物的組織或器官分裂、增殖旺盛,思考題,11、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)表面為何要光滑、無(wú)毒？,12、培養(yǎng)瓶中的

36、細(xì)胞培養(yǎng)到什么時(shí)候就不再分裂、增殖？,13、如此時(shí)細(xì)胞數(shù)量并未達(dá)到人們的需求，應(yīng)該怎樣辦？,易于培養(yǎng)細(xì)胞貼壁，進(jìn)行生長(zhǎng)增殖,當(dāng)貼壁細(xì)胞分裂生長(zhǎng)到表面相互接觸時(shí)，細(xì)胞分裂就會(huì)停止分裂增殖，這種現(xiàn)象叫接觸抑制。,將貼滿細(xì)胞壁的細(xì)胞用胰蛋白酶處理，然后繼續(xù)增殖。,這樣的過(guò)程叫做傳代培養(yǎng),思考題,14、如何理解原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)？,15、傳代培養(yǎng)的細(xì)胞能一直傳代下去嗎？,16、有些為何能一直傳下去？,上述過(guò)程中，在第一培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)就是原代培養(yǎng)，

37、之后轉(zhuǎn)移到其它培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)就是傳代培養(yǎng),不都能,發(fā)生突變，朝著癌細(xì)胞方向發(fā)展,思考題,17、人類一般保存的是哪類細(xì)胞呢？為什么？,保存10代以內(nèi)的細(xì)胞，因?yàn)?0－50部分細(xì)胞的細(xì)胞核型可能發(fā)生變化，有少部分還發(fā)生突變向癌細(xì)胞方向發(fā)展,思考題,18、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)能否像綠色植物組織培養(yǎng)那樣最終培養(yǎng)成新個(gè)體？,不能，動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)只能使細(xì)胞數(shù)目增多，不能發(fā)育成新的動(dòng)物個(gè)體,1、無(wú)菌、無(wú)毒的環(huán)境 （添加一定量的抗生素，定期更換培養(yǎng)液）2、營(yíng)養(yǎng)

38、（葡萄糖、氨基酸、促生長(zhǎng)因子、無(wú)機(jī)鹽、微量元素、維生素、血清、血漿等。合成培養(yǎng)基）,保證細(xì)胞順利的生長(zhǎng)增殖,培養(yǎng)條件：,動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)液的主要成分：,葡萄糖、氨基酸、促生長(zhǎng)因子、無(wú)機(jī)鹽、微量元素、維生素、血清、血漿等。,與植物培養(yǎng)基相比其特點(diǎn)是：,,（1）液體培養(yǎng)基,（2）含有血清、血漿,動(dòng)物體細(xì)胞大都生活在液體的環(huán)境,培養(yǎng)條件：,3、溫度和pH 36.5+（-）0.5度, 7.2-7.44、氣體環(huán)境： O2和

39、CO2（95%空氣和5% CO2 ）,培養(yǎng)條件：,1、無(wú)菌、無(wú)毒的環(huán)境 （添加一定量的抗生素，定期更換培養(yǎng)液）2、營(yíng)養(yǎng)（葡萄糖、氨基酸、促生長(zhǎng)因子、無(wú)機(jī)鹽、微量元素、維生素、血清、血漿等。合成培養(yǎng)基）,思考題,動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)液的主要成分是什么？較植物組培培養(yǎng)基有何獨(dú)特之處？,主要成分：葡萄糖、氨基酸、促生長(zhǎng)因子、無(wú)機(jī)鹽、微量元素、維生素、血清、血漿等。,獨(dú)特之處有：1、液體培養(yǎng)基 2、成分中有血清、血漿等,概念：將動(dòng)物的一個(gè)

40、細(xì)胞的細(xì)胞核，移入一個(gè)已經(jīng)去掉細(xì)胞核的卵母細(xì)胞中，使其重組并發(fā)育成一個(gè)新的胚胎，這個(gè)新的胚胎最終發(fā)育成動(dòng)物個(gè)體。 用核移植的方法得到的動(dòng)物稱為克隆動(dòng)物,核移植,（難度高）,受體細(xì)胞：MⅡ期的卵母細(xì)胞,二、動(dòng)物體細(xì)胞核移植技術(shù)和克隆動(dòng)物,細(xì)胞分化程度低，恢復(fù)全能性容易,動(dòng)物克?。▌?dòng)物細(xì)胞核移植技術(shù)）,核移植過(guò)程涉及動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)、顯微注射技術(shù)、早期胚胎培養(yǎng)技術(shù)、胚胎移植技術(shù)等手段。,——?jiǎng)游矬w細(xì)胞核具有全能性,（1）供體細(xì)胞：,采用傳

41、代10代以內(nèi)的細(xì)胞,原因：,培養(yǎng)的動(dòng)物細(xì)胞一般當(dāng)傳代至10—50代左右時(shí)，部分細(xì)胞核型可能會(huì)發(fā)生變化，其細(xì)胞遺傳物質(zhì)可能會(huì)發(fā)生突變，而10代以內(nèi)的細(xì)胞一般能保持正常的二倍體核型。,（2）受體細(xì)胞：,去核的卵母細(xì)胞【減數(shù)第二次分裂中期（MⅡ期）的次級(jí)卵母細(xì)胞,原因：,a. 卵母細(xì)胞體積大，便于操作。,b. 卵黃多，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)豐富。,c. 含有激發(fā)細(xì)胞分裂分化的物質(zhì)，使細(xì)胞核易于表達(dá)全能性。,（3）克隆屬于無(wú)性繁殖，產(chǎn)生的新個(gè)體的性別、基因型

42、及絕大多數(shù)性狀與供核親本一致,克隆動(dòng)物絕大部分DNA來(lái)自供體細(xì)胞核，但核外還有少部分DNA（如線粒體DNA）來(lái)自受體卵母細(xì)胞,（4）克隆動(dòng)物的研究意義,1.克隆動(dòng)物作為生物反應(yīng)器，生產(chǎn)醫(yī)用蛋白2.改良動(dòng)物品種 3.治療人類疾病，作為供體4.保護(hù)瀕危動(dòng)物,局限性：1.許多克隆動(dòng)物表現(xiàn)出遺傳和生理缺陷，如體型過(guò)大，異常肥胖，發(fā)育困難，免疫失調(diào)等。2.成功率非常低及克隆動(dòng)物食品的安全性問(wèn)題。,１、在體細(xì)胞的細(xì)胞核移植到

43、受體卵母細(xì)胞之前，為什么必須先去掉受體卵母細(xì)胞的核？,為使核移植動(dòng)物的遺傳物質(zhì)全部來(lái)自有利用價(jià)值的動(dòng)物提供的細(xì)胞。,２、用于核移植的供體細(xì)胞一般都選用傳代10代以內(nèi)的細(xì)胞，為什么？,10代以內(nèi)的細(xì)胞一般保持正常二倍體的核型，未發(fā)生突變,思考題,3、體細(xì)胞核移植方法生產(chǎn)的克隆動(dòng)物是對(duì)體細(xì)胞供體動(dòng)物進(jìn)行了100%的復(fù)制嗎？為什么？,不是，克隆動(dòng)物絕大部分DNA來(lái)自供體細(xì)胞核，但核外還有少部分DNA（如線粒體DNA）來(lái)自受體卵母細(xì)胞,思考題,

44、4.動(dòng)物克隆實(shí)例很多，為何多莉就舉世聞名呢？,在1997年2月英國(guó)羅斯林研究所維爾穆特博士科研組公布體細(xì)胞克隆羊“多莉”培育成功之前，胚胎細(xì)胞核移植技術(shù)已經(jīng)有了很大的發(fā)展。實(shí)際上，“多莉”的克隆在核移植技術(shù)上沿襲了胚胎細(xì)胞核移植的全部過(guò)程，但這并不能減低“多莉”的重大意義，因?yàn)樗鞘澜缟系谝焕?jīng)體細(xì)胞核移植出生的動(dòng)物，是克隆技術(shù)領(lǐng)域研究的巨大突破。這一巨大進(jìn)展意味著：在理論上證明了，同植物細(xì)胞一樣，分化了的動(dòng)物細(xì)胞核也具有全能性．,思考

45、題,動(dòng)物細(xì)胞融合,細(xì)胞A,細(xì)胞B,雜種細(xì)胞,滅活的病毒,物理法化學(xué)法,動(dòng)物細(xì)胞融合,單克隆抗體,由單個(gè)B淋巴細(xì)胞經(jīng)過(guò)無(wú)性繁殖（克?。?，形成基因型相同的細(xì)胞群，這一細(xì)胞群所產(chǎn)生的化學(xué)性質(zhì)單一、特異性強(qiáng)的抗體稱為單克隆抗體。 　　特點(diǎn)：特異性強(qiáng)、靈敏度高,單克隆抗體制備過(guò)程,,細(xì)胞融合、篩選,足夠數(shù)量的、能產(chǎn)生特定抗體的細(xì)胞群,,單克隆抗體,2、作為載體，運(yùn)載抗癌藥物，形成“生物導(dǎo)彈”治療腫瘤,植物體細(xì)胞雜交和動(dòng)物細(xì)胞融合的比較,