基于IBDV為模型的dsRNA病毒反向遺傳學(xué)研究.pdf

1、RNA病毒反向遺傳學(xué)的發(fā)展極大地推動(dòng)了RNA病毒的分子生物學(xué)研究和新型疫苗的開發(fā)。dsRNA病毒宿主范圍廣泛,對(duì)人或動(dòng)物造成了重大危害和經(jīng)濟(jì)損失。但其反向遺傳學(xué)的發(fā)展則遠(yuǎn)遠(yuǎn)落后于正鏈或負(fù)鏈RNA病毒。本研究以雙RNA病毒科的傳染性法氏囊病病毒(IBDV)為模式病毒,就dsRNA病毒的反向遺傳進(jìn)行探索性研究。
　　 首先克隆了IBDV ZJ2000株基因組B節(jié)段全長(zhǎng)cDNA,ZJ2000株基因組B節(jié)段全長(zhǎng)為2827bp,在GenB

2、ank(登錄號(hào)為DQ166818。ZJ2000株和TL2004株的體內(nèi)、體外生物實(shí)驗(yàn)表明ZJ2000和TL2004株原代病毒均能直接適應(yīng)CEF細(xì)胞,并引起明顯的細(xì)胞病變,ZJ2000株在CEF細(xì)胞上的復(fù)制速度明顯慢于弱毒株JD1株和HZ2株,TL2004株對(duì)9-11胚齡的SPF雞胚和sPF雞均有較強(qiáng)的致病性。對(duì)GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中雙RNA病毒進(jìn)行生物信息學(xué)分析,在國(guó)內(nèi)外首次發(fā)現(xiàn)雙RNA病毒科中IBDV和IPNV各自的基因組重配現(xiàn)象,并

3、在國(guó)內(nèi)外首次提出雙RNA病毒基因組重配模型。IBDV基因組重配毒株說(shuō)明IBDV的毒力除VP2外,多重因素可以影響IBDV的毒力,尤其是B節(jié)段在決定毒力方面扮演著重要角色。
　　 以IBDv為模型,應(yīng)用重疊PCR法在IBDV基因組A、B兩節(jié)段的5’末端和3’末端分別引入具有自我剪切功能的核酶HamRz和HDV序列,分別克隆到PCI真核表達(dá)載體當(dāng)中,構(gòu)建真核載體PCI-ma和PCI-mb,建立并聯(lián)式共轉(zhuǎn)染的IBDV反向遺傳系統(tǒng),成功

4、實(shí)現(xiàn)了以IBDVHZ2株為母毒的IBDV的遺傳拯救。繼而應(yīng)用紅色和綠色報(bào)告基因構(gòu)建串連式表達(dá)載體,該載體含兩個(gè)獨(dú)立的轉(zhuǎn)錄單位,結(jié)果顯示報(bào)告基因串連式載體在同一靶細(xì)胞內(nèi)的共表達(dá)情況明顯優(yōu)于兩報(bào)告基因共轉(zhuǎn)染在同一細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)效率。將IBDV基因組A、B節(jié)段以串連的方式構(gòu)建到同一載體當(dāng)中,該載體含兩個(gè)獨(dú)立的轉(zhuǎn)錄單位,載體命名為PCI-mab。將PCI-mab轉(zhuǎn)染細(xì)胞進(jìn)行病毒拯救,其拯救效率比并聯(lián)式拯救效率提高100倍。
　　 以IBD

5、V為模型,應(yīng)用PCR法在IBDV基因組A、B兩節(jié)段的5’末端和3'末端分別引入T7啟動(dòng)子和核酶HDV序列,構(gòu)建T7啟動(dòng)子控制下的IBDV感染性載體PT-mA和PT-mB。在脂質(zhì)體介導(dǎo)下將PT-mA和PT-mB共轉(zhuǎn)染經(jīng)痘病毒vTF7-3預(yù)先感染1h的Vero細(xì)胞,建立了基于輔助病毒表達(dá)T7 RNA聚合酶的IBDV反向遺傳系統(tǒng),成功實(shí)現(xiàn)了以IBDV HZ2株為母毒的IBDV的遺傳拯救。
　　 以IBDV為模型,成功實(shí)現(xiàn)了不依賴輔助病

6、毒、借助表達(dá)T7 RNA聚合酶的細(xì)胞系的dsRNA病毒的遺傳拯救。分別從原核表達(dá)菌株BL21工程菌基因組和痘病毒VTF7-3基因組中克隆T7 RNA聚合酶基因,結(jié)果顯示克隆的基因同源性為100％。將T7 RNA聚合酶基因構(gòu)建到逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pLPCX中,經(jīng)包裝細(xì)胞PT67包裝后得到具有感染性而不具有自我復(fù)制功能的假病毒顆粒JVT7,再將假病毒顆粒JVT7感染Vero細(xì)胞,經(jīng)嘌呤霉素篩殺,建立了表達(dá)T7 RNA聚合酶的細(xì)胞系V-T7,并用