2023年全國(guó)碩士研究生考試考研英語(yǔ)一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁(yè)
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1、多酚氧化酶(Polyphenol oxidase,PPO,EC.1.10.3.1)對(duì)茶葉品質(zhì)的形成起關(guān)鍵作用,尤其與紅茶品質(zhì)的形成更是密切相關(guān)。茶樹(shù)PPO除可應(yīng)用于提高紅茶品質(zhì)外,還可應(yīng)用于制備茶黃素及酚類(lèi)廢水治理等方面的研究。本課題選用國(guó)家級(jí)茶樹(shù)良種宜紅早和地方優(yōu)良茶樹(shù)品種安徽一號(hào)為材料,以鮮葉基因組DNA為模板,克隆了茶樹(shù)PPO基因,并進(jìn)行原核表達(dá),最終獲得了具有生物活性的茶樹(shù)PPO工程蛋白,為應(yīng)用于紅茶加工以及茶黃素生物制劑的研發(fā)

2、等方面提供了理論基礎(chǔ)。研究結(jié)果如下:
   (1)茶樹(shù)多酚氧化酶的基因克隆與生物信息學(xué)分析
   直接以宜紅早和安徽一號(hào)的基因組DNA為模板,擴(kuò)增PPO基因,將獲得的PPO基因測(cè)序,并對(duì)其基因和蛋白質(zhì)序列進(jìn)行了生物信息學(xué)分析,結(jié)果表明安徽一號(hào)和宜紅早的PPO基因序列與GenBank中已公布的其它茶樹(shù)品種的PPO基因高度同源,尤其是在銅離子結(jié)合部位。茶樹(shù)PPO為細(xì)胞質(zhì)中合成的親水性不穩(wěn)定蛋白,不存在跨膜螺旋,沒(méi)有信號(hào)肽,但

3、是含有葉綠體轉(zhuǎn)移肽,協(xié)助PPO定位于葉綠體中。在此基礎(chǔ)上,對(duì)PPO蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行了分析,并成功構(gòu)建了其三維結(jié)構(gòu)模型。所獲得的基因序列已在GenBank中登陸注冊(cè),登陸號(hào)為EU787433(宜紅早1800bp)、FJ210643(安徽一號(hào)1800 bp)、FJ210644(安徽一號(hào)1799 bp)、FJ210645(安徽一號(hào)1803 bp)。
   (2)茶樹(shù)多酚氧化酶的原核表達(dá)與酶活力測(cè)定
   嘗試了pET20bn

4、、pET28a、pET32a和pET20b四種蛋白表達(dá)載體表達(dá)茶樹(shù)PPO,結(jié)果發(fā)現(xiàn)表達(dá)載體的種類(lèi)與PPO的表達(dá)量有明顯的相關(guān)性。以pET28a和pET20b為載體不表達(dá);pET20bn雖能表達(dá)PPO,但表達(dá)量偏低;以pET32a為表達(dá)載體,PPO能大量表達(dá),盡管極易形成包涵體,但依然有小量可溶性蛋白。因此,最終選擇pET32a作為茶樹(shù)PPO的表達(dá)載體??赡苡捎诎不找惶?hào)PPO基因在擴(kuò)增過(guò)程中產(chǎn)生了突變,致使其在大腸桿菌中沒(méi)能表達(dá),因此我們

5、在本試驗(yàn)中只對(duì)宜紅早PPO基因大量表達(dá),以鎳離子親和柱純化可溶性的部分,經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測(cè),發(fā)現(xiàn)除目的蛋白外,還含有較明顯的兩條雜蛋白。將所得PPO工程蛋白進(jìn)行酶活性檢測(cè),活力可達(dá)20.867U。
   (3)茶樹(shù)多酚氧化酶亞蛋白的原核表達(dá)
   以純化的安徽一號(hào)(FJ210643)和宜紅早(EU787433)PPO基因?yàn)槟0?,?duì)PPO亞蛋白的基因序列進(jìn)行了擴(kuò)增,分別為PPO-1532bp和PPO-1053bp。

6、原核表達(dá)SDS-PAGE電泳檢測(cè)的結(jié)果表明,與PPO全長(zhǎng)基因相比,亞蛋白基因更容易在大腸桿菌中表達(dá),說(shuō)明導(dǎo)肽對(duì)蛋白表達(dá)量有顯著影響。對(duì)PPO亞蛋白粗酶液酶活性進(jìn)行測(cè)定,發(fā)現(xiàn)切去導(dǎo)肽后的亞蛋白粗酶液活性高于全長(zhǎng)蛋白粗酶液,因此可用于大量純化和制備PPO亞蛋白。
   (4)茶樹(shù)多酚氧化酶包涵體的變性與復(fù)性
   大量表達(dá)獲得宜紅早PPO、宜紅早PPO-1532和安徽一號(hào)PPO-1532的包涵體蛋白,采取變性后超濾復(fù)性,SD

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