豬源呼腸孤病毒分子流行病學(xué)調(diào)查及分離株的鑒定.pdf

1、2011年，我國(guó)豬群中暴發(fā)一種以腹瀉等為主要癥狀的傳染病。為了研究“豬腹瀉病”中主要病毒性病原在國(guó)內(nèi)的流行情況，本研究對(duì)豬源哺乳動(dòng)物呼腸孤病毒進(jìn)行了分子流行病學(xué)調(diào)查;分析了MRV國(guó)內(nèi)流行株與國(guó)內(nèi)外其它毒株間的遺傳演化關(guān)系。在對(duì)病毒分離鑒定方法認(rèn)識(shí)的基礎(chǔ)上，利用Vero細(xì)胞分離到一株豬源1型呼腸孤病毒;構(gòu)建了分離株的全長(zhǎng)cDNA克隆。本研究為我國(guó)豬群中主要病毒病原的分子流行病學(xué)特征提供科學(xué)依據(jù)，同時(shí)也豐富了豬源MRV流行病學(xué)研究資源。本研

2、究具體內(nèi)容如下:
　　1、中國(guó)部分地區(qū)豬群中哺乳動(dòng)物呼腸孤病毒分子流行病學(xué)調(diào)查
　　為了研究中國(guó)豬群中哺乳動(dòng)物呼腸孤病毒(Mammalian Reovirus，MRV)的分子流行病學(xué)，本試驗(yàn)用巢式RT-PCR檢測(cè)2010年1月到2012年12月送檢的不同豬場(chǎng)病料，并對(duì)其中45份陽(yáng)性病料的核酸進(jìn)行濃縮后用根據(jù)S1基因設(shè)計(jì)的型特異性的引物進(jìn)行RT-PCR，同時(shí)將擴(kuò)增產(chǎn)物純化并克隆至T載體經(jīng)測(cè)序后進(jìn)行進(jìn)化分析。進(jìn)化分析結(jié)果表明這些

3、毒株分屬血清1、2、3型。3型毒株為優(yōu)勢(shì)流行毒株，流行范圍覆蓋大陸絕大部分地區(qū)。這些結(jié)果豐富了國(guó)內(nèi)MRV基因變異情況的數(shù)據(jù)，將為新的診斷方法的建立、流行病學(xué)監(jiān)測(cè)以及有效的防控措施制定提供理論基礎(chǔ)。
　　2、一株豬源1型呼腸孤病毒的分離及鑒定
　　通過(guò)在細(xì)胞培養(yǎng)液中添加胰酶的方法，從仔豬腹瀉糞樣中分離、純化并鑒定了1株能在Vero細(xì)胞上穩(wěn)定產(chǎn)生細(xì)胞病變(CPE)，以細(xì)胞顆粒增多、腫脹、漂落等細(xì)胞病變?yōu)橹饕卣鞯牟《?，?jīng)病毒純化

4、，通過(guò)電鏡觀察、核酸提取、RNA電泳、RT-PCR、各病毒基因擴(kuò)增、克隆測(cè)序、S1基因的同源性分析和核苷酸系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹分析等方法對(duì)分離株進(jìn)行了病毒學(xué)鑒定，證明為豬源1型呼腸孤病毒，定名為SHR-A株。此為國(guó)內(nèi)首次報(bào)道從豬體內(nèi)分離到的血清1型的呼腸孤病毒。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，SHR-A的S1基因全長(zhǎng)為1465bp，其3'-UTR為3型，其余部分則為1型，說(shuō)明其S1基因是1型和3型的嵌合體，表明哺乳動(dòng)物呼腸孤作為RNA病毒，基因重組可能是其除

5、基因突變和基因重排以外的第三種病毒變異進(jìn)化的重要方式。
　　3、呼腸孤病毒SHR-A株全長(zhǎng)cDNA克隆的構(gòu)建及序列分析
　　對(duì)豬源SHR-A株全基因序列測(cè)序，為我國(guó)豬源呼腸孤病毒病原學(xué)研究奠定基礎(chǔ)。采用RT-PCR方法分10個(gè)片段擴(kuò)增SHR-A株全基因序列;病毒5'-末端與3'-末端序列采用RACE方法擴(kuò)增，擴(kuò)增得到的各片段克隆測(cè)序。將測(cè)序得到的個(gè)片段序列采用Seqman軟件拼接后，得到了SHR-A分離株全長(zhǎng)序列，其總長(zhǎng)度為

6、23608nt，包括4個(gè)小片段(S1-S4)、三個(gè)中等大小片段(M1-M3)以及三個(gè)大片段(L1-L3)。成功獲得SHR-A株全基因序列，豐富了豬源MRV流行病學(xué)研究資源。
　　4、呼腸孤病毒1型S1、S4基因在sf9昆蟲細(xì)胞中的表達(dá)
　　為研究1型呼腸孤病毒σ1和σ3蛋白功能和建立呼腸孤病毒1型血清學(xué)診斷方法，建立了分離株S1、S4兩個(gè)基因的桿狀病毒-Sf9昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)。采用PCR方法擴(kuò)增該病毒的全長(zhǎng)為1465bp的S

7、1基因和1196bp的S4基因，將其分別插入桿狀病毒轉(zhuǎn)座載體pBAC-1中，構(gòu)建的重組質(zhì)粒pBAC～S1和pBAC～S4，再分別和BacMagic-3DNA共轉(zhuǎn)染sf9昆蟲細(xì)胞，共培養(yǎng)10日后獲得桿狀病毒重組病毒rB-S1和rB-S4。免疫熒光法(IFA)和western blotting檢測(cè)結(jié)果表明，S1基因和S4在Sf9昆蟲細(xì)胞中表達(dá)出約為50kD和41kD的重組蛋白，且具有免疫原性。為進(jìn)一步研究單克隆抗體的制備和血清學(xué)抗體水平檢測(cè)