缺鋅脅迫下柑橘的生理變化及ZIP家族基因克隆與表達(dá)分析.pdf

1、鋅是柑橘生長(zhǎng)發(fā)育必不可少的微量礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)元素，參與核酸、蛋白質(zhì)合成、脂質(zhì)代謝、激素代謝、光合作用、生物膜完整性的維持、活性氧的清除等多種生理生化過(guò)程。然而，缺鋅在柑橘生產(chǎn)中普遍存在，極大影響柑橘產(chǎn)量和品質(zhì)?，F(xiàn)有的營(yíng)養(yǎng)診斷與矯治手段也難以解決柑橘缺鋅問(wèn)題。為此，本研究擬從基礎(chǔ)研究入手，研究柑橘在缺鋅脅迫下的生理生化及基因表達(dá)變化規(guī)律，克隆柑橘缺鋅響應(yīng)相關(guān)基因，并進(jìn)行功能預(yù)測(cè)分析，為發(fā)展新的柑橘缺鋅早期診斷與矯治方法奠定理論基礎(chǔ)。
　　

2、本研究以田間8年生卡里佐枳橙(Carrizo citrange，Citrus sinensis(L.) Osbeck×Poncirus trifoliata(L.) Raf.)砧鳳晚臍橙為試驗(yàn)材料，測(cè)定不同程度斑駁黃化缺鋅葉片的礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)元素含量、葉綠素含量、光合作用能力、抗氧化酶活性及ZIP(ZRT,IRT-like protein)家族基因的表達(dá)水平;以水培缺鋅處理枳(Poncirus trifoliata(L.)Raf.)幼苗為試驗(yàn)

3、材料，測(cè)定缺鋅脅迫處理不同時(shí)間下根、葉中ZIP基因的表達(dá)水平并克隆相關(guān)基因序列。主要結(jié)果如下:
　　1、缺鋅對(duì)柑橘葉綠素含量和光合作用的影響。首先對(duì)田間對(duì)照、輕度、中度和重度斑駁黃化葉片的11種營(yíng)養(yǎng)元素含量測(cè)定分析表明，隨黃化程度加重，鋅含量顯著下降，其他元素?zé)o顯著差異，證明缺鋅是導(dǎo)致葉片黃化的主要原因。以此葉片樣品測(cè)定葉綠素含量和光合作用表明:隨缺鋅程度（黃化程度）的加重，葉綠素含量和類胡蘿卜素含量逐漸下降，其中中度、重度缺鋅葉

4、片較對(duì)照葉片呈極顯著下降，但輕度缺鋅葉片與對(duì)照葉片無(wú)顯著性差異;葉片凈光合速率隨缺鋅程度加重呈現(xiàn)顯著的下降趨勢(shì)，氣孔導(dǎo)度和蒸騰速率也均有不同程度的下降，胞間CO2濃度在重度缺鋅時(shí)比對(duì)照、輕度和中度缺鋅時(shí)均有較大提高。
　　2、缺鋅對(duì)柑橘抗氧化能力的影響。與對(duì)照葉片相比，輕度缺鋅葉片可溶性蛋白質(zhì)含量顯著升高，中度和重度缺鋅葉片則顯著下降;對(duì)酶活性的影響則表現(xiàn)為重度缺鋅葉片的POD、SOD和CAT酶活性顯著增強(qiáng)，Cu-Zn SOD酶活

5、性顯著下降，其它無(wú)顯著性差異。
　　3、ZIP家族基因在田間不同缺鋅程度柑橘葉片中表達(dá)差異。與對(duì)照葉片相比，ZIP1基因在輕度缺鋅時(shí)表達(dá)量下調(diào)1.8倍，而在中度、重度缺鋅葉片中顯著升高;ZIP3和ZIP4基因表達(dá)量隨缺鋅程度的加劇呈顯著升高趨勢(shì)，ZIP2基因表達(dá)量則在各分析樣品中無(wú)顯著變化。上述結(jié)果說(shuō)明，ZIP家族不同基因在不同程度的缺鋅脅迫下表達(dá)量有所不同，其中ZIP1、ZIP3和ZIP4基因明顯受缺鋅誘導(dǎo)。
　　4、ZI

6、P家族基因在枳水培幼苗不同缺鋅時(shí)間下表達(dá)變化。枳幼苗在缺鋅處理不同時(shí)間后，分析了ZIP家族基因在根系和葉片中的表達(dá)水平。在根系中，ZIP1基因在缺鋅第3天表達(dá)量顯著上調(diào)，15天達(dá)到最高，是0天時(shí)的11倍;在葉片中，ZIP1基因在缺鋅第1天就上調(diào)表達(dá)2倍以上，其中15天時(shí)上調(diào)約24倍。ZIP2基因在根系中無(wú)顯著表達(dá)變化，各時(shí)間點(diǎn)趨于平穩(wěn)，在葉片中，僅在缺鋅9天和15天上調(diào)表達(dá)約2.5倍。ZIP3和ZIP4基因在根系中，以及ZIP3基因在葉

7、片中，隨缺鋅時(shí)間的延長(zhǎng)，表達(dá)量呈逐漸上升趨勢(shì)，其中ZIP3基因均是在缺鋅第15天時(shí)達(dá)到最高，第21天在葉片中稍有下降，ZIP4基因在根系中缺鋅第9天達(dá)到最高，15天時(shí)稍有下降。ZIP4基因在葉片中，在缺鋅1天、3天、5天、9天時(shí)表達(dá)上調(diào)約2-3倍，但在15天時(shí)表達(dá)量顯著升高至18.3倍。上述結(jié)果表明，ZIP1、ZIP3和ZIP4基因受缺鋅誘導(dǎo)明顯。
　　5、ZIP家族基因克隆。本試驗(yàn)從枳中同源克隆出3個(gè)ZIP基因完整CDS(Cod

8、ing sequence)序列，分別命名為PtrZIP1、PtrZIP2和PtrZIP4，片段大小分別為1224bp、1373bp和1488bp。PtrZIP1基因包括一個(gè)長(zhǎng)度為1056bp的ORF(OpenReading Frame)，編碼351個(gè)氨基酸，其蛋白分子量大小約為37.5kD，理論等電點(diǎn)約為5.6; PtrZIP2基因包括一個(gè)長(zhǎng)度為639bp的ORF，編碼212個(gè)氨基酸，蛋白分子量大小約為23.3kD，理論等電點(diǎn)約為4.6