一種新的尖吻蝮蛇毒類凝血酶FⅧac的分離純化、生化特征及生物活性研究.pdf

1、蝮亞科、蝰亞科毒蛇的蛇毒中存在多種可影響凝血和纖溶系統(tǒng)的酶類，其中一種能直接使纖維蛋白原凝集的組分——類凝血酶受到廣泛的關(guān)注。迄今為止已有40多種類凝血酶的組分被分離純化，并且其中一些類凝血酶已經(jīng)發(fā)展為臨床治療藥物，如Ancrod,Crotalase，Batroxobin以及立止血等，在治療血栓栓塞性疾病和出血性疾病中獲得了良好的療效。尖吻蝮蛇(Agkistrodon acutus)，又稱五步蛇，隸屬爬行綱(Reptilia)，有鱗目(

2、Squamata)，蝰科(Viperidae)，蝮亞科(Crotalinae)。尖吻蝮蛇毒中富含類凝血酶成分，目前翟寧、肖昌華及潘華等均已報道從五步蛇蛇毒中分離純化出了類凝血酶的組分，但它們的分子性質(zhì)各不相同，提示在五步蛇毒中存在多種類凝血酶的組分。目前，臨床藥物中還沒有尖吻蝮蛇毒類凝血酶的止血制劑。尖吻蝮蛇是我國的特有蛇種，資源豐富，開發(fā)尖吻蝮蛇毒來源的止血制劑具有廣闊的發(fā)展前景。 目的： 本文選用了尖吻蝮蛇的蛇毒干粉

3、，試圖從中分離純化出一個新的具有止血應用前景的類凝血酶組分，并研究其理化性質(zhì)、生物活性等方面的內(nèi)容。 方法： 1.尖吻蝮蛇毒經(jīng)過DEAE-Sephadex A-50離子交換層析，SuperdextmG-75分子凝膠過濾層析及Benzamidine Sepharose CL-6B親和凝膠層析三步分離純化； 2.SDS-PAGE鑒定其純度； 3.質(zhì)譜MALDI-TOF-TOF-MS測定分子量； 4.等

4、電聚焦電泳測定等電點； 5.用Ouyang和Teng的方法檢測FⅧac降解纖維蛋白原的作用； 6.用纖維蛋白平板法測定FⅧac對纖維蛋白的降解作用； 7.用李書寬的方法檢測FⅧac的精氨酸酯酶活性； 8.用Naha和Sorrentuno的方法檢測FⅧac體外凝血活性，并用Francis SM等的方法測定FⅧac的凝血酶比活；用特異性底物法研究FⅧac對凝血因子X、凝血酶原的激活作用，用尿素法研究FⅧac對

5、凝血因子XⅢ的激活作用； 9.以纖維蛋白原為底物，用反應板法測定溫度、pH、金屬離子以及抑制劑對FⅧac酶活性影響； 10.FⅧac通過SDS-PAGE轉(zhuǎn)至PVDF膜，采用Edman降解法測定其N端序列。 結(jié)果： 1.尖吻蝮蛇毒粗毒經(jīng)過DEAE-Sephadex A-50離子交換層析，SuperdexTM G-75分子凝膠過濾層析及Benzamidine Sepharose CL-6B親和凝膠層析三步分離

6、純化后，分離得到一個具有凝血活性的組分(FⅧac)，該蛋白為單鏈蛋白質(zhì)，分子量為31600.925 Da，等電點為4.6； 2.FⅧac可水解人和牛纖維蛋白原的Aα鏈，長時間作用(24h)可水解人纖維蛋白原的Bβ鏈，對牛纖維蛋白原Bβ鏈無作用，對γ鏈無作用，且降解纖維蛋白原有劑量、時間依賴性；FⅧac對纖維蛋白無降解作用；測得FⅧac的精氨酸酯酶活力為33.3±12.8U／mg； 3.FⅧac可劑量依賴性促使血漿和纖維蛋

7、白原凝固；對凝血因子XⅢ、凝血因子X、凝血酶原無激活作用； 4.FⅧac的適宜pH為7-10，適宜溫度為25-60℃；FⅧac的活性可被PMSF和Aprotinin抑制； 5.FⅧac的N端序列為NH2-V-I-G-G-V-E-C-D-I-N。 小結(jié)： 1.尖吻蝮蛇毒毒經(jīng)過DEAE-Sephadex A-50離子交換層析，SuperdexTM G-75分子凝膠過濾層析及Benzamidine Sephar

8、ose CL-6B親和凝膠層析分離純化，得到一個具有凝血活性的組分(FⅧac)；FⅧac可劑量依賴性促使血漿和纖維蛋白原凝固；不激活其他凝血因子，并且具有精氨酸酯酶活性，提示FⅧac是一種類凝血酶； 2.FⅧac為單鏈絲氨酸蛋白酶，分子量為31600.925 Da，等電點為4.6，N端序列為NH2-V-I-G-G-V-E-C-D-I-N；FⅧac可水解人和牛纖維蛋白原的Aα鏈，長時間作用(24h)可水解人纖維蛋白原的Bβ鏈，對兩