microRNA對(duì)肝癌組織微環(huán)境中CD4+CD25+CD127dim--Treg細(xì)胞的調(diào)控.pdf

1、[研究背景和目的]：在肝癌免疫微環(huán)境中,CD4+CD25+CD127dim/-Treg細(xì)胞是一類重要的具有免疫負(fù)向調(diào)節(jié)作用的T淋巴細(xì)胞,腫瘤微環(huán)境中的腫瘤抗原和細(xì)胞因子對(duì)于Treg細(xì)胞的募集、擴(kuò)增和誘導(dǎo)有重要的作用。然而,腫瘤微環(huán)境中為何會(huì)產(chǎn)生IL-2、IL-10和TGFβ1等促進(jìn)腫瘤生長的細(xì)胞因子,它們受到何種機(jī)制的調(diào)控尚不明確。本研究通過分析肝癌組織中與CD4+CD25+CD127dim/-Treg細(xì)胞差異表達(dá)的相關(guān)microRNA

2、,探討microRNA在肝癌免疫耐受網(wǎng)絡(luò)中的調(diào)控機(jī)制。
　　[方法]：采用microRNA芯片技術(shù)分析CD4+CD25+CD127dim/-Treg細(xì)胞高表達(dá)的肝癌組織與CD4+CD25+CD127dim/-Treg細(xì)胞低表達(dá)的肝癌組織之間miRNA表達(dá)譜的差異;通過Real-timeqPCR方法進(jìn)一步驗(yàn)證microRNA芯片結(jié)果。應(yīng)用生物信息學(xué)方法預(yù)測miR-608的靶基因,通過Real-timeqPCR、WesternBlot

3、實(shí)驗(yàn)以及構(gòu)建靶基因表達(dá)載體,雙熒光報(bào)告系統(tǒng)檢測系統(tǒng)驗(yàn)證microRNA-608的靶基因。
　　[結(jié)果]：
　　1、通過microRNA芯片技術(shù)分析CD4+CD25+CD127dim/-Treg細(xì)胞高表達(dá)的肝癌組織與CD4+CD25+CD127dim/-Treg細(xì)胞低表達(dá)的肝癌組織之間microRNA表達(dá)譜差異,結(jié)果顯示表達(dá)水平顯著改變(>2folddifference)的microRNA有20個(gè)。在Treg高表達(dá)的肝癌組織中

4、上調(diào)的microRNA有7個(gè):miR-1224-3p,miR-181b,miR-21,miR-221,miR-23b,miR-4259,miR-92a。在Treg高表達(dá)的肝癌組織中下調(diào)的microRNA有13個(gè):miR-1258-p,miR-1973,miR-210-p,miR-3178-p,miR-323-5p,miR-375-p,miR-4301,miR-494,miR-608,miR-708,miR-934,miR-133a-2-

5、p,miR-134-p。
　　2、通過Real-timeqPCR實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證miRNA芯片結(jié)果。驗(yàn)證結(jié)果為在Treg高表達(dá)的肝癌組織中miR-21-5p、miR-221-3p上調(diào),miR-608下調(diào),與芯片結(jié)果相符。
　　3、利用生物信息學(xué)軟件,我們預(yù)測TGFβ1及FoxP3為miR-608的靶基因。
　　4、利用WesternBlot實(shí)驗(yàn),檢測在HepG2、SMMC7721、293T細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-608mimi

6、c或miR-608inhibitor后培養(yǎng)72h時(shí)TGFβ1蛋白水平的變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染了miR-608mimic,這三種細(xì)胞系的TGFβ1蛋白水平均有明顯下調(diào)趨勢。而轉(zhuǎn)染了miR-608inhibitor,293T細(xì)胞的TGFβ1蛋白水平有明顯上調(diào)趨勢,HepG2、SMMC7721細(xì)胞的TGFβ1蛋白水平無明顯變化。
　　5、利用Real-timeqPCR實(shí)驗(yàn),檢測在HepG2、SMMC7721、293T細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-608

7、mimic或miR-608inhibitor后培養(yǎng)48h時(shí)TGFβ1mRNA水平的變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染了miR-608mimic或miR-608inhibitor,這三種細(xì)胞系的TGFβ1mRNA水平均無明顯變化(P>0.05)。
　　6、構(gòu)建了含靶基因TGFβ1及FoxP3的3’UTR區(qū)的表達(dá)載體,通過雙熒光報(bào)告基因檢測,證實(shí)了miR-608與靶基因3’UTR區(qū)的相互作用。推測TGFβ1可能是miR-608的靶基因。
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