互花米草耐鹽相關(guān)基因NHX的克隆及功能分析.pdf

1、由于氣候變化、社會(huì)經(jīng)濟(jì)的高速發(fā)展以及人類不合理地灌溉耕作等導(dǎo)致了土壤鹽漬化及次生鹽漬化的日趨加重，從而使得植物的生長(zhǎng)發(fā)育受到了越來(lái)越大的威脅。高鹽脅迫會(huì)給植物帶來(lái)眾多危害，主要包括生理干旱、離子毒害、生理代謝紊亂等，從而嚴(yán)重影響農(nóng)作物的產(chǎn)量。對(duì)于大部分的植物來(lái)說(shuō)，高鹽脅迫給植物帶來(lái)的危害主要是由于高濃度的 Na+的積累所導(dǎo)致的。盡管不同植物的耐鹽機(jī)制存在一定的差異，但是其基本的策略都是保持胞內(nèi) Na+的平衡。眾多研究表明，Na+/H+逆

2、向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白可以通過(guò)介導(dǎo) Na+的轉(zhuǎn)運(yùn)來(lái)減輕高鹽脅迫對(duì)植物的危害。目前已經(jīng)從多種植物中克隆到了編碼Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的基因，而且通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)將這些基因過(guò)量表達(dá)到其他植物體內(nèi)可以提高轉(zhuǎn)基因植株的耐鹽性，對(duì)于解決土壤鹽漬化問(wèn)題具有非常重要的作用。
　　互花米草（Spartina alterniflora）是一種高度耐鹽的鹽生植物，它主要生活在沿海灘涂的潮間帶，且具有很好的耐淹、抗風(fēng)浪的能力。這些特點(diǎn)使得互花米草成為研究植物耐鹽機(jī)制

3、材料的很好選擇。
　　本實(shí)驗(yàn)采用鹽生植物互花米草為實(shí)驗(yàn)材料，克隆并分析了編碼Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的 SaNHX1、SaNHX2和 SaNHX3基因在脅迫條件下的表達(dá)變化。并且構(gòu)建了植物過(guò)量表達(dá)載體，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化擬南芥和水稻，并對(duì)獲得的純合轉(zhuǎn)基因擬南芥株系進(jìn)行了耐鹽性分析。具體實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下：
　?。?）基因的克隆及序列分析
　　根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室互花米草轉(zhuǎn)錄組測(cè)序中得到的部分片段信息設(shè)計(jì)特異性引物，并利用RACE技

4、術(shù)克隆得到了三個(gè)編碼Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的基因全長(zhǎng)序列，分別命名為SaNHX1、SaNHX2和SaNHX3。其中SaNHX1 cDNA全長(zhǎng)為2277 bp，編碼540個(gè)氨基酸殘基；SaNHX2 cDNA全長(zhǎng)為2091 bp，編碼539個(gè)氨基酸殘基；SaNHX3 cDNA全長(zhǎng)為1985 bp，編碼522個(gè)氨基酸殘基。經(jīng)比對(duì)發(fā)現(xiàn)這三個(gè)基因與水稻、玉米、小麥等的NHX基因親緣關(guān)系較近。
　?。?）基因表達(dá)量的變化
　　分別用6

5、00 mmol/L NaCl溶液和100μmol/L ABA溶液對(duì)互花米草幼苗進(jìn)行澆灌和噴灑，處理時(shí)間分別為0h(對(duì)照)、3h、6h、12h、24h，結(jié)果顯示，SaNHX1、SaNHX2和SaNHX3這三個(gè)基因的表達(dá)量都隨著脅迫處理時(shí)間的延長(zhǎng)發(fā)生了相應(yīng)的變化，因此推測(cè)這三個(gè)基因在互花米草抗逆機(jī)制中可能發(fā)揮著重要作用。
　?。?）基因的異源表達(dá)研究
　　對(duì)篩選得到的純合轉(zhuǎn)基因擬南芥株系進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)，分析不同轉(zhuǎn)基因

6、株系中外源基因表達(dá)量的差異。最終選取相對(duì)表達(dá)量較高的兩個(gè)株系進(jìn)行種子萌發(fā)、根長(zhǎng)測(cè)量以及相應(yīng)的生理生化指標(biāo)的測(cè)定。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在相同的鹽處理?xiàng)l件下，轉(zhuǎn)基因擬南芥的萌發(fā)情況，根長(zhǎng)生長(zhǎng)情況都要明顯優(yōu)于野生型。并且鮮重、葉綠素、電導(dǎo)率、MDA、Na+、K+含量等指標(biāo)也都證實(shí)了轉(zhuǎn)基因擬南芥的生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)。這充分說(shuō)明這三個(gè)基因的過(guò)量表達(dá)對(duì)于提高擬南芥植株的耐鹽性具有重要的作用。
　　此外，對(duì)篩選得到的T2代水稻株系進(jìn)行了擴(kuò)繁，以期望得到純合株系