不同作物Tic40對新型嵌合基因Bnams4b功能的影響.pdf

1、甘藍(lán)型油菜核不育系統(tǒng)7365AB(Bnams3ms3ms4bms4b/BnaMs3ms3ms4bms4b)由于不育性穩(wěn)定、敗育徹底，具有廣泛的恢復(fù)源等特點(diǎn)，成為目前油菜雜種優(yōu)勢利用的重要途徑之一。不育基因Bnams4b能夠引起油菜和擬南芥花藥功能性缺失和葉片黃化，導(dǎo)致雄性不育。BnaMs3是Bnams4b的恢復(fù)基因，能夠恢復(fù)Bnams4b的破壞效應(yīng)，但BnaMs3在其它作物中的同源基因與Bnams4b的關(guān)系以及對Bnams4b的功能有什

2、么影響，目前還沒有相關(guān)研究。本研究將不育基因Bnams4b和恢復(fù)基因BnaMs3轉(zhuǎn)化到普通煙草和栽培番茄A57中，對Bnams4b在其它作物中的功能以及不同作物Tic40對Bnams4b功能的影響進(jìn)行研究。主要研究結(jié)果如下:
　　1.煙草的遺傳轉(zhuǎn)化和陽性鑒定
　　將不育基因Bnams4b轉(zhuǎn)化到煙草中，獲得陽性株。取不同黃化程度的轉(zhuǎn)基因植株葉片進(jìn)行qRT-PCR。結(jié)果顯示，Bnams4b基因的表達(dá)量隨轉(zhuǎn)基因煙草葉片黃化程度的增

3、加而升高。
　　2.轉(zhuǎn)基因煙草的表型分析
　　轉(zhuǎn)基因煙草葉片出現(xiàn)了不同程度的黃化，對其黃化葉片進(jìn)行透射電鏡觀察和葉綠素含量檢測，發(fā)現(xiàn)葉綠素含量隨葉片由黃到綠呈逐漸升高的趨勢，黃化葉片中的葉綠體結(jié)構(gòu)出現(xiàn)異常。醋酸洋紅染色結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)基因黃化煙草的花藥能夠產(chǎn)生有活力的花粉粒，并未出現(xiàn)預(yù)期的雄性不育表型。
　　3.轉(zhuǎn)基因煙草未出現(xiàn)不育的原因分析
　　對轉(zhuǎn)基因煙草未出現(xiàn)不育的原因進(jìn)行分析，首先更換花藥特異啟動子A9和TA

4、29后轉(zhuǎn)化煙草，依然沒有出現(xiàn)雄性不育表型;其次對煙草不同Tic40拷貝的功能進(jìn)行分析，結(jié)果證實(shí)煙草的各Tic40拷貝都不能恢復(fù)Bnams4b引起的擬南芥雄性不育表型。
　　4.轉(zhuǎn)基因番茄的陽性鑒定和表達(dá)量分析
　　將番茄A57的Tic40拷貝轉(zhuǎn)化擬南芥，與包含Bnams4b的擬南芥雜交，結(jié)果顯示番茄的Tic40拷貝不能恢復(fù)Bnams4b引起的擬南芥雄性不育。將不育基因Bnams4b和恢復(fù)基因BnaMs3導(dǎo)入番茄中，出現(xiàn)了黃化

5、表型，qRT-PCR顯示葉色黃化程度越重，Bnams4b的表達(dá)量越高，花藥中也有一定程度的表達(dá)。
　　5.轉(zhuǎn)基因番茄的表型分析和育性觀察
　　共得到19株Bnams4b轉(zhuǎn)基因番茄陽性苗，有6株葉片黃化，相同的生長環(huán)境下黃化株比正常的栽培材料生長矮小。其中兩株花藥中沒有花粉粒，部分轉(zhuǎn)化株的花藥中有少量可育花粉粒和大量于癟的、沒有活力的花粉粒。黃化程度最嚴(yán)重的單株出現(xiàn)死蕾現(xiàn)象，不能正常結(jié)實(shí)。
　　6.煙草和番茄Tic40中

6、的功能變異位點(diǎn)分析
　　將擬南芥、甘藍(lán)型油菜、煙草、番茄的Tic40進(jìn)行氨基酸序列比對分析。結(jié)果顯示，番茄Tic40中的六個(gè)功能位點(diǎn)與Bnams3完全一致，推測番茄Tic40與Bnams3有類似功能，番茄中只有存在類似于Bnams3的Tic40拷貝時(shí)，Bnams4b才能表現(xiàn)出較強(qiáng)的破壞功能。煙草Tic40序列中的第一個(gè)功能位點(diǎn)與BnaMs3和Bnams3的都不相同，且缺失了第六個(gè)功能位點(diǎn)，結(jié)合轉(zhuǎn)基因煙草沒有得到不育表型，推測與煙草