胃癌及區(qū)域淋巴結(jié)微衛(wèi)星DNA序列不穩(wěn)定性和CK18表達(dá)的研究.pdf

1、微衛(wèi)星(microsatellite,MS)是指一類不編碼的,數(shù)量可變的,廣泛存在于原核及真核基因組中,具有高度多態(tài)性,簡單串聯(lián)式的核苷酸重復(fù)序列。MS由2～6個核苷酸組成,多位于基因編碼區(qū)附近,也可位于內(nèi)含子和啟動子中,遵循孟德爾遺傳規(guī)律,呈遺傳穩(wěn)定性。MS通過改變DNA結(jié)構(gòu)和與特異性蛋白結(jié)合發(fā)揮基因調(diào)控作用,是基因重排和變異的來源。
　　 微衛(wèi)星DNA序列不穩(wěn)定性(Microsatellite Instability,MSI

2、)是指由DNA復(fù)制錯誤(Replication Errors,RER)引起的簡單重復(fù)序列的改變,表現(xiàn)為腫瘤組織與其相應(yīng)的非腫瘤組織DNA結(jié)構(gòu)性等位基因的大小發(fā)生改變。MSI最早在1993年發(fā)現(xiàn)于遺傳性非息肉性結(jié)腸癌(HereditaryNonpolyposis Colorectal Cancer,HNPCC),后又陸續(xù)在胃癌、胰腺癌、子宮內(nèi)膜癌、卵巢癌、小細(xì)胞肺癌等腫瘤中發(fā)現(xiàn)。迄今為止,幾乎每一類型的腫瘤都已被證明有MSI的存在。

3、>　　 產(chǎn)生MSI的主要原因是錯配修復(fù)(Mismatch Repair MMR)功能缺陷,不能正常地發(fā)揮錯配修復(fù)作用。MMR缺陷所致的MSI通過DNA的復(fù)制和細(xì)胞分裂而被保存在基因組中,增加了其他基因的不穩(wěn)定性,進(jìn)而出現(xiàn)整個基因組的不穩(wěn)定性,導(dǎo)致細(xì)胞增殖及分化異常,從而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生。
　　 某等位基因的基因型由雜合狀態(tài)變?yōu)榘牒闲?Hemizygosity)、純合性(Homozygosity)、或零和性(Nulizygosit

4、y)稱為雜合子丟失(Loss ofHeterozygosity,LOH)。絕大多數(shù)人類腫瘤都存在非隨機性的染色體片段缺失。染色體上特異性等位基因丟失,是人類腫瘤基因組中常見的遺傳學(xué)改變。MS多態(tài)位點與抑癌基因緊密連鎖,根據(jù)Knudson的“兩次打擊”學(xué)說,若在染色體某一位點處頻發(fā)LOH,則此位點附近可能存在抑癌基因。探討LOH現(xiàn)象,有助于研究腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中的隱性遺傳變化及其機制。
　　 腫瘤的微轉(zhuǎn)移是指惡性腫瘤在發(fā)展過程中,

5、腫瘤細(xì)胞播散并存活于血循環(huán)、淋巴管、骨髓及各組織器官中,未形成轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié),無任何臨床表現(xiàn),常規(guī)檢查方法如影像、病理等難以發(fā)現(xiàn)。多數(shù)學(xué)者以2mm作為微轉(zhuǎn)移灶的上限。1993年國際抗癌聯(lián)盟(UICC)在腫瘤TNM分期補充材料中指出:當(dāng)微小腫瘤轉(zhuǎn)移灶生長到直徑在1～2mm時稱為微轉(zhuǎn)移。傳統(tǒng)的病理學(xué)檢查對確定腫瘤微小轉(zhuǎn)移灶的作用有限。早期發(fā)現(xiàn)腫瘤患者淋巴結(jié)中的微轉(zhuǎn)移對腫瘤轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的判斷以及對指導(dǎo)臨床綜合治療均具有重要價值。隨著對胃癌微轉(zhuǎn)移的深入

6、研究,在分子水平上診斷胃癌淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移已成為可能。
　　 細(xì)胞角蛋白(CK)是一種中間絲蛋白,是構(gòu)成細(xì)胞骨架的必要成分。它不表達(dá)于正常淋巴結(jié)中,并且CK亞型的表達(dá)有助于區(qū)分原發(fā)腫瘤和轉(zhuǎn)移癌,是檢測淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移的常用指標(biāo)。細(xì)胞角蛋白18(CK18)主要標(biāo)記各種單層上皮。檢測CK18在胃癌中的表達(dá),目前在文獻(xiàn)中報道較少。
　　 本研究以胃癌組織和區(qū)域淋巴結(jié)為研究對象,采用PCR、RT-PCR和免疫組化等方法,檢測其中CK18

7、及D2S123、D3S1577、D7S520、D9S257、D18S58和hMLH1、hMSH2等的表達(dá),研究微轉(zhuǎn)移和微衛(wèi)星等因素在胃癌的發(fā)生和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中的作用,探討胃癌發(fā)生發(fā)展的分子生物學(xué)基礎(chǔ),旨在對胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的預(yù)防、治療和判斷預(yù)后提供實驗依據(jù)。
　　 第一部分胃癌及區(qū)域淋巴結(jié)微衛(wèi)星DNA序列不穩(wěn)定性的研究
　　 目的:研究微衛(wèi)星DNA序列不穩(wěn)定性和胃癌及區(qū)域淋巴結(jié)之間的聯(lián)系,開辟胃癌的診斷、治療及病情判斷等問題

8、上新的認(rèn)識途徑。
　　 方法:應(yīng)用PCR方法,檢測胃癌組織及區(qū)域淋巴結(jié)中D2S123、D3S1577、D7S520、D9S257及D18S58 DNA的表達(dá)水平,并分析其與胃癌臨床生物學(xué)行為的關(guān)系。
　　 結(jié)論:
　　 1 D2S123、D3S1577、D7S520、D9S257和D18S58五個基因位點中均發(fā)生MSI,其中D9S257位點MSI的發(fā)生率最高。同時,MSI陽性組織中,D9S257位點MSI-H的發(fā)

9、生率同樣最高?？梢?D9S257是MSI活躍的位點。
　　 2 MSI與患者性別、年齡、胃癌的細(xì)胞分化程度、組織類型、Lauren分型等方面無統(tǒng)計學(xué)差異。
　　 3在直徑＜5cm、T1+T2期、Ⅰ～Ⅱ胃癌中MSI的陽性率較高?？梢?MSI陽性多發(fā)生在較小的腫瘤體積,較淺的腫瘤浸潤和較早的腫瘤分期中。
　　 4各位點區(qū)域淋巴結(jié)中MSI的陽性率無明顯差異。
　　 第二部分胃癌及區(qū)域淋巴結(jié)中CK18 mRNA表

10、達(dá)的研究
　　 目的:研究胃癌組織及區(qū)域淋巴結(jié)中CK18 mRNA表達(dá)與胃癌微轉(zhuǎn)移的關(guān)系。
　　 方法:選取行胃癌根治術(shù)的病人,應(yīng)用RT-PCR方法,檢測胃癌組織、無轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)組織中CK18 mRNA的表達(dá),并分析其與胃癌臨床生物學(xué)行為的關(guān)系。
　　 結(jié)論:
　　 1常規(guī)病理檢查陰性的淋巴結(jié)中,CK18 mRNA表達(dá)陽性,提示存在胃癌淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移。
　　 2 CK18 mRNA多在胃腺癌及其區(qū)域淋

11、巴結(jié)中表達(dá)。
　　 3淋巴結(jié)中表達(dá)CK18 mRNA的胃癌,其腫瘤大小較大,浸潤程度較深,病程進(jìn)展較晚,易發(fā)生腫瘤的轉(zhuǎn)移。
　　 4檢測CK18 mRNA,對胃癌淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移的檢測具有一定的診斷價值。
　　 5常規(guī)病理檢查陰性處于PN0期的淋巴結(jié),經(jīng)RT-PCR法檢出CK.18 mRNA表達(dá),提示應(yīng)屬PN1期?？梢?胃癌淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移的研究將有助于更準(zhǔn)確地掌握淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移規(guī)律,更為科學(xué)地進(jìn)行臨床分期。
　　

12、6 RT-PCR方法對CK18 mRNA的檢測具有較高的敏感性和特異性,具有良好的應(yīng)用前景。
　　 第三部分胃癌及區(qū)域淋巴結(jié)hMLH1、hMSH2及CK18蛋白表達(dá)的研究
　　 目的:檢測胃癌及區(qū)域淋巴結(jié)中hMLH1和hMSH2及CK18蛋白表達(dá),比較其檢測結(jié)果,并統(tǒng)計其5年生存率,為胃癌的預(yù)防和治療提供實驗依據(jù)。
　　 方法:應(yīng)用免疫組化技術(shù),檢測胃癌及區(qū)域淋巴結(jié)中hMLH1和hMSH2及CK18蛋白表達(dá),并比

13、較其預(yù)后。
　　 結(jié)論:
　　 1胃腺癌中hMSH2,區(qū)域淋巴結(jié)中hMLH1和hMSH2蛋白表達(dá)的陽性率高于其他病理類型,提示hMLH1和hMSH2蛋白表達(dá)與腺癌關(guān)系密切;
　　 2在浸潤較淺腫瘤及淋巴結(jié)中,hMLH1、hMSH2蛋白表達(dá)豐富,說明MSI與較淺的腫瘤浸潤相關(guān)。
　　 3 CK18蛋白多在腺癌及其淋巴結(jié)中表達(dá);在T3+T4期胃癌及淋巴結(jié)中,CK18蛋白表達(dá)較高,說明CK18蛋白多表達(dá)在浸潤較