精液傳播弓形蟲的實驗研究.pdf

1、弓形蟲病由弓形蟲而引起，該蟲體可寄生于人類及多數(shù)溫血動物，引起人獸共患弓形蟲病。人類免疫力正常時其感染通常沒有癥狀，但對免疫缺陷者可引起致死性損害，屬最常見的機會致病原蟲。孕婦感染弓形蟲后，蟲體多數(shù)能傳給胎兒造成先天性損害。在畜牧業(yè)，弓形蟲能引起動物疾病及胚胎流產(chǎn)而造成嚴重的經(jīng)濟損失和影響畜牧業(yè)發(fā)展。 該蟲生活史復雜，存在著眾多的感染途徑。目前已知蟲體能經(jīng)口傳播，通常因生食、或半生食動物肉類或飲水而感染。孕婦感染弓形蟲后蟲體由胎

2、盤傳給胎兒。能經(jīng)輸血而傳播；也存在著經(jīng)傷口接觸蟲體而導致感染的可能性。還有報導因貓咬傷而感染弓形蟲。 近年來發(fā)現(xiàn)，弓形蟲病的分布有以下特點：歐美地區(qū)感染率高，而欠發(fā)達地區(qū)其感染率低。在我國弓形蟲感染率有逐年增高的趨勢，1985～1996年國內(nèi)平均感染率為4.9％。2004年的國內(nèi)弓形蟲感染率為7.88％。感染率升高的原因與國內(nèi)居民飲食習慣，接觸貓科動物等因素有關系。但是否與社會性觀念的改變及婚外性行為的增加有關尚不得而知。

3、 弓形蟲寄生在宿主除紅細胞以外的所有有核細胞內(nèi)，常見的受損器官有腦、眼、心、肝、肺、腎等。在睪丸組織和精液中已發(fā)現(xiàn)蟲體的存在。而且在女性陰道分泌物內(nèi)已檢測到蟲體DNA的存在。弓形蟲能否經(jīng)性行為傳播及雌性陰道狀態(tài)對精液傳播弓形蟲的影響是一個至今尚未深入探討的話題。 多年來，由于弓形蟲蟲體的微小及在宿主體內(nèi)常以隱性感染狀態(tài)出現(xiàn)，因此弓形蟲的感染檢測常靠免疫學手段進行；檢測方式均為定性檢測。而其病原學檢測常采用小鼠腹腔接種的方式。因

4、此，對弓形蟲蟲體本身在宿主體內(nèi)的動態(tài)變化未能進行研究。1996年熒光定量PCR技術的出現(xiàn)及2000年在弓形蟲檢測上的應用為研究帶來希望。因此本文以RH株弓形蟲為蟲株，以家兔為實驗動物建立雄性弓形蟲感染模型和雌兔不同陰道健康狀態(tài)模型。采用普通PCR和熒光定量PCR技術對雄性家兔血液、精液中蟲體進行了動態(tài)觀察；通過弓形蟲抗體和DNA的檢測，觀察了不同陰道健康狀態(tài)的雌兔在利用感染弓形蟲的雄兔精液授精后雌兔的感染情況。 一、家兔實驗動物

5、模型的建立 建立雄性家兔弓形蟲感染模型和雌性家兔不同陰道健康狀態(tài)模型。用16只健康成年新西蘭雄兔，每只經(jīng)腹腔感染RH株弓形蟲速殖子10萬個，在感染前后耳緣靜脈每周采集外周血，制備全血標本和血清標本；假陰道法采集精液標本。27只雌性成年健康家兔，體重3kg左右，隨機分為4組。第一組，陰道正常組(7只雌兔)；第二組，陰道損傷組(7只)；第三組，陰道毛滴蟲感染組(7組)；第四組，白色念珠菌感染組(6只)。第一組雌性家兔為陰道健康狀態(tài)組

6、；第二組每天用消毒棉簽插拭陰道，出血為止。第三組每天用培養(yǎng)的陰道毛滴蟲蟲體液滴加陰道內(nèi)，直至陰道有淡黃色分泌物出現(xiàn)，且分泌物內(nèi)顯微鏡下能查到滴蟲蟲體為止。第四組每天陰道內(nèi)滴加培養(yǎng)的白色念珠菌菌液，直至陰道分泌物中查見菌體為止。 結論表明： RH株蟲體以1×105劑量感染家兔，死亡率在50％左右，精液標本采集較血液困難。利用雌性家兔能建立類似于人類陰道健康狀況的模型。 二、弓形蟲感染動物免疫學檢測方法的建立

7、 建立家兔血清中弓形蟲IgG抗體檢測的酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)。用純化后的RH株弓形蟲速殖子反復凍融、多次超聲粉碎后超速離心，取上清制備蟲體抗原，包被進口酶標反應板。用已知混合的弓形蟲感染陽性血清倍比稀釋后滴加酶標反應孔內(nèi)，以辣根過氧化物酶標記的羊抗兔抗體作為二抗，鄰苯二胺為底物進行棋盤滴定以獲得最佳的抗原包被濃度及血清稀釋度。 結論表明： 本次建立的家兔血清中抗體檢測ELISA方法是成功的。 三、弓形蟲感

8、染動物體液中蟲體DNA的定性檢測方法的建立 評價國內(nèi)公司研制的弓形蟲PCR檢測試劑盒，篩選出較好的檢測方法用于家兔體液中蟲體DNA檢測。采用市售的國內(nèi)生產(chǎn)的4種弓形蟲PCR試劑盒檢測弓形蟲陽性兔的血液及精液標本。 結果表明： 溫州伊利康TOX-PCR試劑盒、北京美迪科TOX-PCR試劑盒對家兔感染前后血液、精液標本均未出現(xiàn)陽性結果。上海復生TOX-PCR試劑盒檢測家兔精液標本感染前陰性，感染后均能出現(xiàn)相應的結果，

9、而檢測血液標本雜帶太多。洛陽華美TOX-PCR試劑盒檢測家兔血液標本、精液感染前均為陰性，感染后血液標本陽性率76.53％，43份精液標本陽性率2.33％。 結論表明： 目前國內(nèi)市售的TOX-PCR試劑盒可檢測各種組織標本，但實際應用價值局限。復生試劑盒適合于家兔精液中弓形蟲DNA的檢測；華美公司試劑適合于血液中蟲體DNA的檢測。 四、弓形蟲感染動物體液中蟲體DNA的定量檢測方法的建立 利用TaqMan探

10、針法建立熒光定量PCR進行家兔血液、精液中蟲體DNA的定量檢測。用弓形蟲蟲體單拷貝熱休克蛋白基因Hsp20(基因總長度片段為240bp,表達產(chǎn)生20kd的熱休克蛋白)，設計一對特異引物，其序列如下：F：5‘-GCGACATGGACGAGATGCT-3’R：5‘-CAGTTGGCCTTCGCCGACC-3’，建立熒光定量PCR技術。采用堿加熱法提取精液中總DNA，碘化鈉法提取血液中總DNA。采用美國應用生物系統(tǒng)公司QRT-PCR儀PE70

11、00進行PCR反應。 結果表明： 8份感染前的全血均陰性；感染后1～3周全血7份全部陽性。感染前雄兔精液6份檢測均為陰性；感染后4～9周5份精液3份(3/5)能測定出一定蟲體密度。 結論表明： 本次建立的熒光定量PCR技術敏感性和特異性能滿足定量檢測需要。 五、弓形蟲感染家兔血液、精液中蟲體的動態(tài)研究 觀察弓形蟲蟲體在血液、精液中動態(tài)變化情況。對比普通PCR和FQ-PCR檢測感染家兔血液中

12、弓形蟲基因動態(tài)檢測結果。用RH株弓形蟲速殖子105個/只的劑量腹腔感染雄性家兔16只。在家兔感染前后分別采集血液、精液，-40℃凍存?zhèn)溆谩Ｆ胀≒CR連續(xù)檢測血液標本中蟲體DNA基因片段；用實時定量PCR(QRT-PCR)方法檢測弓形蟲感染家兔血液、精液中弓形蟲DNA拷貝量，依據(jù)標準曲線計算出血液、精液中蟲體密度，繪制感染后時間與血液、精液中蟲體含量的動態(tài)曲線圖。 結果表明： FQ-PCR檢測：感染前雄性家兔血液檢測均為陰

13、性，感染后血液總陽性率為64.42％。血液中蟲體密度高峰期在感染后1wk左右，其密度最高值為2.48×105個/ml，其后長期維持在較低水平，感染后121d血液蟲體密度達最低值為1.45×103個/ml。精液檢測總陽性率為26.67％，最早在感染后7d能檢測到蟲體DNA，精液中蟲體最大密度值為1.48×105個/ml，高峰期在感染后7wk左右，峰期過后，精液中蟲體密度維持在平臺期水平，至感染后第15wk，精液中仍有4.68×103個/m

14、l蟲體存在。 普通PCR檢測：感染家兔血液中蟲體DNA檢測總陽性率為45％，感染后第1wk檢出率僅22％，高峰期維持在感染后2～4wk,檢出率約為60％左右。其后檢出率下降為25％左右并一直維持。用普通PCR檢測感染雄兔精液，感染后8d有較強反應，感染72d仍有陽性反應出現(xiàn)。 結論表明： 兩種PCR檢測方法有相同的動態(tài)檢出效果，采用血液作為樣品進行弓形蟲PCR檢測時其最佳檢測時間為感染后1～4wk，其后檢出率逐漸

15、下降。弓形蟲感染雄兔其血液、精液中蟲體含量動態(tài)變化不同。 六、實驗動物精液傳播弓形蟲的研究 為了解弓形蟲能否通過精液傳播，并探討雌兔陰道不同健康狀態(tài)對精液傳播弓形蟲的影響。8只健康新西蘭雄兔經(jīng)腹腔分別感染1×105個RH株弓形蟲速殖子，分別于感染前、后用假陰道采集雄兔精液，每周將采集到的精液混合液化后分別經(jīng)宮腔內(nèi)人工授精管感染4組(0.1ml/只))陰道健康狀態(tài)不同的成年新西蘭雌兔(陰道正常組、陰道損傷組、滴蟲性陰道炎組

16、和霉菌性陰道炎組)，共采集8周，將所得8份混合精液分別感染8次。每次授精后第2～3天耳緣靜脈采血(2ml)，分別用ELISA和PCR檢測血清抗弓形蟲抗體和全血中弓形蟲B1基因片段。ELISA結果顯示，雌兔在初次受精后第16天可檢測到抗弓形蟲IgG抗體，第1～4組抗體陽性家兔數(shù)分別有2、1、3和1只，ELISA陽性率為25.9％(7/27)。PCR檢測最早在授精后3d和最晚51d可擴增出弓形蟲B1基因片段200bp，第1～4組陽性家兔數(shù)分

17、別有2、1、2和0只，PCR陽性率為18.5％(5/27)。其中兩種檢測結果均為陽性的有3只。結論弓形蟲可通過精液感染雌兔。雌兔的陰道健康狀態(tài)對經(jīng)精液感染弓形蟲無影響。 本項研究得出如下結論：用1×105個/只RH株弓形蟲速殖子感染16只雄性家兔時，有8只在感染后的7～14d死亡。用27只雌性家兔，成功建立了4種不同陰道健康狀態(tài)模型。用建立的普通PCR和熒光定量PCR進行血液中蟲體DNA檢測時發(fā)現(xiàn)，其最佳檢測時間為感染后1～4周