角膜潰瘍修復(fù)材料生物羊膜的生物安全評(píng)價(jià)研究.pdf

1、目的：通過(guò)熱原、急性毒性、溶血、皮內(nèi)刺激、體外細(xì)胞毒性、潛在皮膚致敏性、沙門(mén)氏菌回復(fù)突變、染色體畸變(體內(nèi)哺乳動(dòng)物骨髓細(xì)胞微核實(shí)驗(yàn))、精子致畸和亞慢性毒性試驗(yàn)對(duì)生物羊膜的生物安全性進(jìn)行較全面的評(píng)價(jià)。 方法： (1)在熱原試驗(yàn)中，將一定劑量供試品靜脈注入家兔，觀察3只試驗(yàn)用兔的體溫變化情況； (2)在急性全身毒性試驗(yàn)中，將供試品分別通過(guò)靜脈和腹腔給予昆明鼠，在注射后4、24、48、72h觀察試驗(yàn)組和對(duì)照組昆明鼠的一

2、般狀態(tài)、毒性表現(xiàn)和死亡動(dòng)物數(shù)，以及72h后的動(dòng)物體重； (3)在溶血試驗(yàn)中，將新鮮制備的抗凝兔血加入供試品中，觀察各組是否出現(xiàn)溶血現(xiàn)象，并測(cè)其吸光度； (4)在皮內(nèi)刺激試驗(yàn)中，將供試品注射于家兔背部，觀察接種點(diǎn)的紅斑和水腫情況，并計(jì)算皮內(nèi)刺激反應(yīng)指數(shù)； (5)在體外細(xì)胞毒性試驗(yàn)中，將供試品與特定細(xì)胞系接觸，評(píng)價(jià)其對(duì)細(xì)胞的毒性作用和程度，并用MTT法測(cè)定細(xì)胞相對(duì)增殖率； (6)在潛在皮膚致敏試驗(yàn)中，受試動(dòng)物

3、經(jīng)供試品的兩步誘導(dǎo)和激發(fā)后，觀察激發(fā)部位皮膚情況； (7)在AMES試驗(yàn)中，通過(guò)點(diǎn)滴板評(píng)價(jià)技術(shù)選擇對(duì)測(cè)交品系無(wú)抑制作用的提取液，用標(biāo)準(zhǔn)平板摻入方法進(jìn)行測(cè)試，觀察各組的菌落生長(zhǎng)情況，并計(jì)算被測(cè)樣品菌落計(jì)數(shù)平均值與陰性對(duì)照菌落計(jì)數(shù)平均值的比值； (8)在微核試驗(yàn)中，將受試品腹腔給予受試動(dòng)物，取其雙側(cè)股骨內(nèi)骨髓，制備涂片，油鏡觀察，計(jì)算各組PCEs占紅細(xì)胞總數(shù)的比值，用作骨髓毒性的指示，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)比較； (9)在精子

4、畸形試驗(yàn)中，將受試物腹腔給予受試動(dòng)物，分離附睪，制作涂片，觀察結(jié)構(gòu)完整的1000個(gè)精子，計(jì)數(shù)其中畸形的精子，計(jì)算畸形精子發(fā)生率，采用秩和檢驗(yàn)分析試驗(yàn)組的精子畸變率與陰性對(duì)照組之間的差異； (10)在亞慢性毒性試驗(yàn)中，將測(cè)試樣品無(wú)菌植入受試動(dòng)物腹股溝面的皮下囊袋中，在整個(gè)植入期內(nèi)，每周稱(chēng)重一次，并逐個(gè)進(jìn)行詳細(xì)的臨床檢查。植入期結(jié)束后，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室觀察和病理解剖，并對(duì)觀察結(jié)果進(jìn)行分析。 結(jié)果： (1)熱原實(shí)驗(yàn)中，3只家

5、兔的體溫升高均低于0.6℃，且3只家兔的升溫總和低于1.4℃，可以認(rèn)為生物羊膜沒(méi)有致熱性。 (2)在急性毒性試驗(yàn)中，注射后立即觀察昆明鼠，沒(méi)有出現(xiàn)不良反應(yīng)，在注射后4、24、48、72h繼續(xù)觀察試驗(yàn)組和對(duì)照組昆明鼠的一般狀態(tài)、毒性表現(xiàn)和死亡動(dòng)物數(shù)，以及72h后的動(dòng)物體重，結(jié)果表明試驗(yàn)組動(dòng)物癥狀和體重的變化都在可接受的范圍之內(nèi)，可以認(rèn)為生物羊膜無(wú)急性全身毒性作用。 (3)溶血試驗(yàn)中陽(yáng)性對(duì)照管中觀察到溶血現(xiàn)象，試驗(yàn)品和陰性對(duì)

6、照管中未見(jiàn)溶血現(xiàn)象。移入比色皿內(nèi)測(cè)吸光度，得到試驗(yàn)組溶血率為0.7％，＜5％，結(jié)果表明，生物羊膜沒(méi)有引起溶血反應(yīng)。 (4)皮內(nèi)刺激試驗(yàn)中，皮內(nèi)刺激反應(yīng)指數(shù)為0.0，表明該試驗(yàn)品無(wú)刺激作用。 (5)體外細(xì)胞毒性試驗(yàn)中，顯微鏡下觀察可見(jiàn)陽(yáng)性對(duì)照呈現(xiàn)明顯的細(xì)胞毒性，空白及陰性對(duì)照細(xì)胞形態(tài)正常，試驗(yàn)組觀察到有極輕的毒性。定量測(cè)試結(jié)果表明，試驗(yàn)品毒性為1級(jí)，空白對(duì)照為0級(jí)，而陽(yáng)性對(duì)照為4級(jí)。定量測(cè)試和定性測(cè)試的結(jié)果均表明，生物羊膜

7、具有極輕的細(xì)胞毒性。 (6)潛在皮膚致敏試驗(yàn)中，SC組和CSO組的致敏反應(yīng)情況相同，二者的試驗(yàn)組和陰性對(duì)照組的紅斑和水腫記分等級(jí)均為0，而陽(yáng)性對(duì)照組的紅斑和水腫記分等級(jí)均≥1。所以在本項(xiàng)試驗(yàn)條件下，生物羊膜無(wú)潛在皮膚致敏性。 (7)AMES試驗(yàn)中，各個(gè)菌株的陰陽(yáng)性的自發(fā)回變菌落數(shù)均按預(yù)期生長(zhǎng)，陰性對(duì)照在各自的范圍內(nèi)，陽(yáng)性對(duì)照回變菌落數(shù)均至少為陰性的2倍以上，試驗(yàn)樣品回變菌落數(shù)與陰性對(duì)照基本無(wú)差異。計(jì)算被測(cè)樣品菌落計(jì)數(shù)平均

8、值與陰性對(duì)照菌落計(jì)數(shù)平均值的比值均介于0.5和2之間，表示菌株生長(zhǎng)未受抑制，且受試品對(duì)各受試菌株無(wú)誘導(dǎo)作用。因此，本研究中試驗(yàn)品提取液對(duì)各試驗(yàn)菌株沒(méi)有誘導(dǎo)性，不具有致突變作用。 (8)微核試驗(yàn)中，各組PCEs占紅細(xì)胞總數(shù)的比值的差別均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，計(jì)算各組MPCEs在PCEs中所占的數(shù)量，陽(yáng)性對(duì)照的雌雄兩組與樣品組(SC)的雌雄兩組的差別均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與樣品組(CSO)的雌雄兩組的差別也均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，陰性對(duì)照(SC和CSO)

9、與樣品組(SC和CSO)的差別均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。本次試驗(yàn)結(jié)果表明，試驗(yàn)組沒(méi)有出現(xiàn)細(xì)胞毒性的跡象，可以認(rèn)為被測(cè)樣品浸提液不會(huì)對(duì)小鼠產(chǎn)生遺傳毒性。 (9)精子畸形試驗(yàn)中，試驗(yàn)組小鼠精子畸形發(fā)生率與陰性對(duì)照組比較差異無(wú)顯著性，而CP陽(yáng)性對(duì)照組與陰性對(duì)照組比較有顯著差異。結(jié)果表明在本次研究的條件下，被測(cè)樣品浸提液并未表現(xiàn)出對(duì)小鼠產(chǎn)生遺傳毒性的跡象。 (10)亞慢性毒性試驗(yàn)中，在整個(gè)試驗(yàn)期間，試驗(yàn)組和對(duì)照組對(duì)比，大鼠的一般行為、體重

10、增長(zhǎng)、進(jìn)食、尿常規(guī)、血液學(xué)、血生化、臟器重量及病理檢查均未見(jiàn)顯著性差異。在本次研究條件下，認(rèn)為生物羊膜植入皮下組織92天后，沒(méi)有導(dǎo)致毒性效應(yīng)的特異性變化，不會(huì)引起亞慢性毒性。 結(jié)論：生物羊膜在本研究的試驗(yàn)條件下，無(wú)致熱性，不會(huì)引起急性全身毒性反應(yīng)和溶血反應(yīng)，無(wú)皮內(nèi)刺激反應(yīng)，具有輕微的細(xì)胞毒性，對(duì)皮膚無(wú)潛在致敏性，無(wú)致突變作用，無(wú)遺傳毒性，無(wú)亞慢性毒性，因此，可以認(rèn)為生物羊膜具有較高的生物安全性。關(guān)于生物羊膜在醫(yī)療器械領(lǐng)域的開(kāi)發(fā)應(yīng)