調(diào)節(jié)性T細(xì)胞改善心肌梗死后心室重塑及作用機(jī)制研究.pdf

1、第一部分、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞過繼轉(zhuǎn)輸減輕心肌梗死后心室重塑并改善心功能
　　 目的：急性心肌梗死后（AMI）持續(xù)激活的炎癥反應(yīng)參與心肌梗死后心室重塑的發(fā)生發(fā)展，然而抑制炎癥反應(yīng)的內(nèi)源性保護(hù)機(jī)制尚未明確。CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)是一群具有抑制炎癥反應(yīng)的T細(xì)胞亞群。本實(shí)驗(yàn)的目的觀察Treg對(duì)MI后心室重塑和心功能的影響。
　　 方法：結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支的方法建立大鼠心肌梗死模型，假手術(shù)的大鼠（Sha

2、m）僅予以穿針帶線而不結(jié)扎。免疫組化的方法檢測不同時(shí)間點(diǎn)（第3天，第7天和第14天）梗死心臟中Treg的浸潤。免疫磁珠分選純化的Lewis 大鼠脾臟調(diào)節(jié)性T細(xì)胞和非調(diào)節(jié)性CD4+T細(xì)胞。將MI 大鼠隨機(jī)過繼轉(zhuǎn)輸5×106 調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（MITreg）或非調(diào)節(jié)性CD4+T細(xì)胞（MITconv），部分MI 大鼠僅予以相同量的PBS 作為陰性對(duì)照（MI）。
　　 細(xì)胞過繼后24 小時(shí)觀察過繼轉(zhuǎn)輸T細(xì)胞在梗死大鼠心臟局部和淋巴結(jié)的分布。

3、免疫組化的方法觀察細(xì)胞過繼后第3天梗死心臟中Treg的浸潤。第28天用超聲和血流動(dòng)力學(xué)評(píng)估模型大鼠的心室擴(kuò)張和心功能，指標(biāo)包括心率（HR），左室收縮末內(nèi)徑（LVESD），左室舒張末內(nèi)徑（LVEDD），分?jǐn)?shù)縮短率（FS），左室收縮壓（LVSP），左室舒張末壓（LVEDP），左室壓力最大上升速率(+dp/dtmax)和最小下降速率（-dp/dtmin），Masson 染色法評(píng)估梗死區(qū)（IZ）的梗死面積及梗死周邊區(qū)（PIZ）和非梗死區(qū) (NI

4、Z)的纖維化，明膠酶譜法評(píng)估NIZ的基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）-2的活性，TUNEL 法評(píng)估PIZ和NIZ的心肌細(xì)胞凋亡。
　　 結(jié)果：心肌梗死后的第3天，7天和14天在梗死心臟中均可見Treg，浸潤的細(xì)胞集中于PIZ 且數(shù)目在第7天達(dá)高峰。過繼轉(zhuǎn)輸后，Treg 能夠趨化至MI后梗死心臟和淋巴結(jié)并導(dǎo)致PIZ的Treg 數(shù)目上調(diào)。與Sham組大鼠比較，MI組大鼠左心室擴(kuò)張且心功能減低，LVEDD，LVESD和LVEDP 均升高，LV

5、SP，F(xiàn)S，+dp/dtmax和-dp/dtmin 均降低。
　　 與MI組大鼠比較，MITreg組大鼠的心室擴(kuò)張和心功能顯著改善，LVEDD，LVESD和LVEDP均降低，F(xiàn)S，+dp/dtmax和-dp/dtmin 均升高；梗死面積無明顯改變，PIZ和NIZ的纖維化，NIZ的MMP-2的活性，PIZ和NIZ的心肌細(xì)胞凋亡則顯著降低。MITconv大鼠與MI組大鼠相比較心功能和心室重塑無明顯差異。
　　 結(jié)論：過繼轉(zhuǎn)輸

6、Treg 上調(diào)心肌梗死局部的Treg 浸潤數(shù)目，減輕MI后心室重塑并改善心功能。Treg 可能作為一種內(nèi)源性保護(hù)機(jī)制參與MI后心室重塑的發(fā)生發(fā)展。
　　 第二部分、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞抑制心肌梗死誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)
　　 目的：研究Treg 對(duì)MI 誘導(dǎo)的心臟局部炎癥反應(yīng)和系統(tǒng)細(xì)胞毒性反應(yīng)的影響，探討其減輕心室重塑，改善心功能的作用機(jī)制。
　　 方法：免疫磁珠分選純化的Lewis 大鼠脾臟調(diào)節(jié)性T細(xì)胞和非調(diào)節(jié)性CD4+T細(xì)胞

7、。通過結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支的方法建立大鼠心肌梗死模型，假手術(shù)的大鼠僅予以穿針帶線而不結(jié)扎。將MI 大鼠隨機(jī)過繼轉(zhuǎn)輸5×106 調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（MITreg）或非調(diào)節(jié)性CD4+T細(xì)胞（MITconv），部分MI 大鼠僅予以相同量的PBS 作為陰性對(duì)照（MI）。免疫組化的方法檢測不同時(shí)間點(diǎn)（第3天，第7天和第14天）心臟死周邊區(qū)（PIZ）的炎癥細(xì)胞包括中性粒細(xì)胞（MPO+），巨噬細(xì)胞（CD68+）和 T 淋巴細(xì)胞（CD3+）的浸潤。
　

8、　 RT-PCR的方法比較第7天PIZ 炎癥細(xì)胞因子包括腫瘤壞死因子（TNF）-α，白介素（IL）-1β，轉(zhuǎn)化生長因子（TGF）-β1和IL-10的表達(dá)。結(jié)晶紫法比較第14天脾臟淋巴細(xì)胞對(duì)心肌細(xì)胞的殺傷能力。流式細(xì)胞術(shù)評(píng)估第14天脾臟CD8+細(xì)胞毒性T細(xì)胞的增殖。
　　 結(jié)果：心肌梗死后在PIZ 區(qū)可觀察到明顯的中性粒細(xì)胞，巨噬細(xì)胞和T 淋巴細(xì)胞的浸潤。中性粒細(xì)胞的數(shù)目在第3天達(dá)高峰，在第7天和14天恢復(fù)至基線水平。巨噬細(xì)胞的

9、數(shù)目亦在第3天達(dá)高峰，在第7天和第14天逐漸降低。T 淋巴細(xì)胞的數(shù)目在第7天達(dá)高峰后逐漸降低。與MI組大鼠比較，MITreg組大鼠心肌梗死局部的中性粒細(xì)胞，巨噬細(xì)胞和T 淋巴細(xì)胞的數(shù)目均降低。與Sham組大鼠比較，MI組大鼠心臟PIZ的促炎因子TNF-α和IL-1β，抗炎因子TGF-β1和IL-10的表達(dá)均上調(diào)，脾臟淋巴細(xì)胞對(duì)培養(yǎng)的乳鼠心肌的殺傷能力增加，CD8+細(xì)胞毒性T細(xì)胞增殖率升高。與MI組大鼠比較，MITreg組大鼠心臟中促炎因

10、子TNF-α和IL-1β的表達(dá)減低，抗炎因子IL-10的表達(dá)升高，TGF-β1的表達(dá)則無明顯改變；脾臟淋巴細(xì)胞對(duì)培養(yǎng)的乳鼠心肌的殺傷能力下降，CD8+細(xì)胞毒性T細(xì)胞增殖率降低。MITconv 大鼠與MI組大鼠相比較心肌局部炎癥反應(yīng)和系統(tǒng)細(xì)胞毒性反應(yīng)無明顯差異。
　　 結(jié)論：Treg細(xì)胞抑制心肌梗死誘導(dǎo)的心臟局部炎癥反應(yīng)和系統(tǒng)細(xì)胞毒性反應(yīng)，從而減輕心室重塑，改善心功能。
　　 第三部分、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞抑制心肌細(xì)胞凋亡的作用機(jī)

11、制研究
　　 目的：研究Treg 對(duì)心肌細(xì)胞凋亡的影響和機(jī)制，探討其減輕心室重塑，改善心功能的作用機(jī)制。
　　 方法：單獨(dú)培養(yǎng)的乳鼠心室肌細(xì)胞，或與免疫磁珠法純化的Tconv或Treg以10：1比例共培養(yǎng)的乳鼠心室肌細(xì)胞，經(jīng)CD3 單抗刺激48 小時(shí)再予以LPS 刺激24 小時(shí)后，TUNEL 法評(píng)估心肌細(xì)胞的凋亡，ELISA 法檢測細(xì)胞上清中細(xì)胞因子TNF-α，IL-1β，TGF-β1和IL-10的濃度。
　　

12、結(jié)果：心肌細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)時(shí)，與未加LPS的對(duì)照組相比 (5.2±1.2％)，經(jīng)LPS 刺激后的心肌細(xì)胞凋亡率明顯升高(18.1±1.2％，p<0.01)。與Treg 共培養(yǎng)的心肌細(xì)胞經(jīng)LPS 刺激后的凋亡率(9.2±1.0％，p<0.01)明顯低于單獨(dú)培養(yǎng)時(shí)或與Tconv 共培養(yǎng)(18.7±2.5％)。含有Treg的共培養(yǎng)體系細(xì)胞上清中的細(xì)胞因子TGF-β1和IL-10的濃度明顯高于心肌單獨(dú)培養(yǎng)時(shí)或與含有Tconv的共培養(yǎng)體系。在Treg

13、與心肌細(xì)胞共培養(yǎng)體系中加入單克隆抗體阻斷IL-10的效應(yīng)或者用半透膜阻斷心肌細(xì)胞和Treg的直接接觸后，心肌細(xì)胞凋亡率升高，但仍低于心肌細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)體系中的凋亡率。加入單克隆抗體阻斷TGF-β1后則不影響Treg與心肌細(xì)胞共培養(yǎng)體系中心肌細(xì)胞凋亡。與心肌細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)體系比較，加入Treg 明顯降低心肌細(xì)胞TNF-α和IL-1β的分泌。
　　 結(jié)論：Treg 通過細(xì)胞直接接觸和分泌細(xì)胞因子IL-10 減輕心肌細(xì)胞凋亡，并抑制心肌細(xì)