亞洲玉米螟幾丁質(zhì)酶的晶體結(jié)構(gòu)與抑制劑設(shè)計(jì).pdf

1、糖基水解酶18家族(GH18)幾丁質(zhì)酶(chitinase，EC3.2.1.14)隨機(jī)催化水解幾丁質(zhì)(chitin)和殼糊精(chitodextrins)的β-1，4糖苷鍵。該酶廣泛分布于細(xì)菌、真菌、昆蟲、植物和哺乳動(dòng)物等生物體內(nèi)，在營養(yǎng)、病原菌入侵、節(jié)肢動(dòng)物蛻皮、免疫和防御等生理過程中發(fā)揮著重要作用。解析并獲得GH18幾丁質(zhì)酶的結(jié)構(gòu)和功能的關(guān)系對(duì)于疾病控制、植物保護(hù)和藥物設(shè)計(jì)均具有重要意義。
　　與其他物種相比，昆蟲是GH18幾

2、丁質(zhì)酶含量最豐富的生物體，包含8個(gè)分支。其中g(shù)roupⅠ幾丁質(zhì)酶負(fù)責(zé)昆蟲蛻皮時(shí)舊表皮的幾丁質(zhì)降解，對(duì)于昆蟲的生長發(fā)育至關(guān)重要。目前尚無昆蟲幾丁質(zhì)酶結(jié)構(gòu)與功能的報(bào)導(dǎo)。本論文以農(nóng)業(yè)害蟲亞洲玉米螟的groupⅠ幾丁質(zhì)酶OfChtI為研究對(duì)象，主要獲得以下結(jié)論:
　　1) OfChtI具有獨(dú)特的結(jié)構(gòu)特征
　　重組表達(dá)的全長OfChtI不穩(wěn)定，我們因此重組表達(dá)并結(jié)晶催化域（Of ChtI-CAD），并解析得到分辨率為1.7(A)的Of

3、ChtI-CAD晶體結(jié)構(gòu)(PDB登錄號(hào)3w4r)。
　　晶體結(jié)構(gòu)分析表明OfChtI-CAD包含核心域和幾丁質(zhì)插入域。核心域?yàn)榈湫偷?β/α)8折疊桶結(jié)構(gòu)，催化殘基指紋序列144DxDxE148位于β4和α4之間的loop上，而幾丁質(zhì)插入域形成活性裂縫的一面墻。
　　OfChtI-CAD擁有長且兩端開放的底物結(jié)合裂縫，依次排列9個(gè)可能結(jié)合底物糖基的芳香族氨基酸殘基。其不同于所有已知結(jié)構(gòu)的幾丁質(zhì)酶的特征是:在底物結(jié)合裂縫的末端

4、，有四個(gè)芳香族氨基酸（Phe159、Phe194、Trp240和Tyr290）形成一個(gè)疏水平面。單點(diǎn)突變體F159A、F194A、W241A、Y290A、雙突變體F194A/W241A、F159A/Y290A和四點(diǎn)突變體F159A/F194A/W241A/Y290A結(jié)合幾丁質(zhì)的能力均較野生型OfChtI-CAD低。其中四點(diǎn)突變結(jié)合能力最低，僅為野生型的40％。說明這個(gè)獨(dú)特的疏水平面的生理功能與OfChtI-CAD的幾丁質(zhì)結(jié)合能力正相關(guān)。

5、
　　2) OfChtI具有隨機(jī)水解幾丁寡糖的內(nèi)切活性
　　為了研究OfChtI-CAD水解底物的特性，我們首先利用熱力學(xué)方法分析了幾丁寡糖在OfChtI-CAD活性裂縫中的結(jié)合情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明幾丁寡糖(GlcNAc)3-6與OfChtI-CAD結(jié)合的焓變、熵變均小于零，且|-T△S|＞|△H|，表明結(jié)合均為熵驅(qū)動(dòng)（焓變也產(chǎn)生一部分貢獻(xiàn)），說明結(jié)合主要伴隨著蛋白與底物的構(gòu)像變化和水分子的排出。從(GlcNAc)3到(Glc

6、NAc)6，每增加一個(gè)糖單元，自由能降低1.0 kcal mol-1，表明OfChtI催化域包含至少6個(gè)糖基結(jié)合位點(diǎn)。
　　為了分析OfChtI-CAD的催化特性，我們利用浸泡法，將OfChtI-CAD的晶體與幾丁寡糖(GlcNAc)6共孵育獲得分辨率為1.77(A)的復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)（PDB登錄號(hào)3wl1）。OfChtI-CAD的結(jié)構(gòu)在結(jié)合配基前后具有很好的重疊性，說明幾丁寡糖的進(jìn)入沒有改變酶的活性裂縫以及整體結(jié)構(gòu)。復(fù)合物結(jié)構(gòu)中存

7、在兩個(gè)糖分子:其一為(GlcNAc)3，占據(jù)活性裂縫的-1、-2和-3位點(diǎn);另一個(gè)為(GlcNAc)2，位于+1和+2位點(diǎn)。結(jié)合在-1位點(diǎn)的GlcNAc呈現(xiàn)能量不利的船式構(gòu)像，很可能是催化反應(yīng)剛剛完成時(shí)的狀態(tài):即產(chǎn)物已經(jīng)離去，催化相關(guān)的Asp146仍然與-1 GlcNAc作用。因我們之前的研究表明OfChtI是從底物非還原端開始水解底物，所以(GlcNAc)3應(yīng)該是(GlcNAc)6的水解產(chǎn)物，因此可以推斷OChtI具有內(nèi)切性質(zhì)。

8、>　　3)寡聚葡萄糖胺是OfChtI的抑制劑
　　GH18家族幾丁質(zhì)酶催化水解底物時(shí)采用底物輔助保留機(jī)制，-1位GlcNAc的乙酰基作為親核基團(tuán)進(jìn)攻C1異頭碳。這個(gè)過程將導(dǎo)致-1 GlcNAc的嚴(yán)重扭曲，從而處于能量不利的不穩(wěn)定構(gòu)型。如果-1糖是脫乙酰基的，那么結(jié)合GlcN可能是能量上有利的?；谶@個(gè)假說，我們首次研究并獲得了寡聚葡萄糖胺(GlcN)2-7抑制劑，其IC50值在μM-mM水平。
　　同時(shí)我們也測(cè)試了這些聚糖的

9、體內(nèi)活性。給亞洲玉米螟5齡幼蟲注射(GlcN)2-7混合物，85％的幼蟲不能完成幼蟲到蛹的生理過程，并在10天后死亡。因OfChtI是負(fù)責(zé)昆蟲蛻皮過程中表皮幾丁質(zhì)的降解，所以該實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明(GlcN)2-7可能在昆蟲體內(nèi)抑制了OfChtI的活性。
　　4)寡聚葡萄糖胺對(duì)OfChtI的抑制機(jī)理
　　為了研究寡聚葡萄糖胺抑制劑對(duì)OfChtI的抑制機(jī)理，我們利用熱力學(xué)方法分析了寡聚葡萄糖胺(GlcN)2-7與Of ChtI的結(jié)合過

10、程。結(jié)果表明這些抑制劑與OfChtI結(jié)合的焓變均小于零，且|△H|＞|-T△S|，表明反應(yīng)均為焓驅(qū)動(dòng)，抑制劑與OfChtI的結(jié)合伴隨著氫鍵和/或靜電作用的形成。(GlcN)5、(GlcN)6和(GlcN)7與OfChtI結(jié)合的Kd值相似，說明(GlcN)6,7比(GlcN)5多出的糖基沒有對(duì)親和力產(chǎn)生貢獻(xiàn)。
　　為了研究這些聚糖抑制作用的分子機(jī)制，我們通過浸泡法分別獲得了OfChtI-CAD與(GlcN)5（PDB登錄號(hào)3wqv）

11、和(GlcN)6(PDB登錄號(hào)3wqw)的復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)，分辨率均為2.0(A)。晶體結(jié)構(gòu)表明(GlcN)6的五個(gè)糖與(GlcN)5中的五個(gè)糖基結(jié)合在相同的亞位點(diǎn)上，即-1、-2、-3、-4和-5亞位點(diǎn)。抑制劑復(fù)合物OfChtI-CAD-(GlcN)5與底物復(fù)合物OfChtI-CAD-(GlcNAc)2/3的結(jié)構(gòu)比較顯示抑制劑和底物在-1和-2位點(diǎn)的結(jié)合存在明顯差異。為了研究這兩個(gè)位點(diǎn)對(duì)抑制劑結(jié)合的作用，我們構(gòu)建了突變體E148Q和F3