CD4+T淋巴細(xì)胞異常表達(dá)微小核糖核酸在不穩(wěn)定型心絞痛中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、動(dòng)脈粥樣硬化(Atherosclerosis，AS)是慢性炎癥反應(yīng)和免疫性疾病，是冠心病的主要病理基礎(chǔ)。在AS斑塊中可發(fā)現(xiàn)大量的T淋巴細(xì)胞，其中以CD4+T淋巴細(xì)胞為主，CD4+T淋巴細(xì)胞亞群的失衡與急性冠脈綜合征(Acute coronary syndrome，ACS)發(fā)生關(guān)系密切。易損斑塊中大量活化的T淋巴細(xì)胞降低斑塊的穩(wěn)定性，使斑塊易于破裂。不穩(wěn)定型心絞痛(Unstableangina pectoris，UAP)的患者及急性心肌梗

2、死患者，心肌微血管內(nèi)存在血小板血栓，在心肌微循環(huán)水平形成微栓塞，導(dǎo)致心肌微梗死。因此，CD4+T淋巴細(xì)胞可能間接的參與了ACS患者心肌損傷的過程。
　　術(shù)后心肌損傷仍然是經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療(Percutaneous coronaryintervention，PCI)常見的并發(fā)癥，但其機(jī)制目前尚不完全清楚。有研究表明，PCI術(shù)前大劑量的他汀可以有效的降低炎癥因子水平，保護(hù)心肌。因此，炎癥和免疫反應(yīng)也是PCI術(shù)后心肌損傷的重要原因之

3、一。還有研究表明，PCI對(duì)血管壁的損傷可以導(dǎo)致外周血淋巴細(xì)胞的顯著激活和氧化應(yīng)激產(chǎn)物標(biāo)志物的顯著增高，外周血激活的CD4+T淋巴細(xì)胞表達(dá)的CD18分子可促進(jìn)白細(xì)胞招募并粘附于受損的內(nèi)皮細(xì)胞。因此，炎癥反應(yīng)及以CD4+T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)直接參與了PCI術(shù)后心肌損傷的過程。
　　微小核糖核酸(MicroRNA，miRNA)是一類長(zhǎng)約18～25個(gè)核苷酸的小分子RNA。近年來發(fā)現(xiàn)，miRNA也參對(duì)與AS發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的炎性細(xì)胞如單

4、核/巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞的調(diào)控。
　　雖然目前miRNA在T淋巴細(xì)胞調(diào)控中的研究取得了重大的進(jìn)展，但仍屬于起步階段，并且在不同的疾病狀態(tài)和疾病發(fā)展的不同階段，miRNA表達(dá)和作用亦不盡相同，與T淋巴細(xì)胞活化和功能調(diào)控相關(guān)的miRNA在UAP及PCI術(shù)后心肌損傷中的生物學(xué)功能尚未闡明。
　　本研究擬通過miRNA基因芯片技術(shù)篩選出UAP患者外周血CD4+T淋巴細(xì)胞異常表達(dá)的miRNA，闡明異常表達(dá)的miRNA對(duì)CD4+

5、T淋巴細(xì)胞活化、分化及功能調(diào)控的機(jī)制。同時(shí)探討miRNA在PCI術(shù)后的變化及與心肌損傷相關(guān)性。
　　第一部分 UAP患者循環(huán)血CD4+T淋巴細(xì)胞差異表達(dá)miRNA的篩選及鑒定
　　目的:通過檢測(cè)UAP患者循環(huán)血CD4+T淋巴細(xì)胞中基因的miRNA表達(dá)譜，篩選與正常對(duì)照者差異表達(dá)的miRNA，尋找對(duì)CD4+T淋巴細(xì)胞具有調(diào)控作用的miRNA，為進(jìn)一步闡明miRNA在UAP發(fā)病機(jī)制中的作用提供基礎(chǔ)。
　　方法:選取入住我院

6、的典型UAP患者3例，以疑似不典型冠心病癥狀而冠脈造影正常的住院患者3例作為正常對(duì)照組，抽取新鮮外周靜脈血20ml。利用密度梯度離心法分離出UAP患者和正常對(duì)照者循環(huán)血中的單個(gè)核細(xì)胞（Peripheral blood mononuclear cell，PBMC），免疫磁珠法(Magneticcell sorting system，MACS)進(jìn)一步分離出CD4+T淋巴細(xì)胞。采用流式細(xì)胞術(shù)（Flow cytometry，F(xiàn)CM）檢測(cè)所分離C

7、D4+T淋巴細(xì)胞的純度，臺(tái)酚藍(lán)檢測(cè)活細(xì)胞數(shù)。Trizol一步法提取細(xì)胞總RNA，取40μg總RNA，用聚乙二醇（Polyethylene glycol，PEG）方法分離純化miRNA。用分光光度計(jì)測(cè)定RNA的濃度，甲醛變性膠電泳質(zhì)檢RNA的質(zhì)量。采用AffymetrixmiRNA基因表達(dá)譜芯片進(jìn)行雜交，檢測(cè)CD4+T淋巴細(xì)胞miRNA的表達(dá)譜。用Affymetrix GeneChip Scanner3000基因芯片掃描儀進(jìn)行圖像掃描，A

8、ffymetrix GeneChip Command ConsoleTM1.1圖像分析軟件對(duì)圖像進(jìn)行分析，把圖像信號(hào)轉(zhuǎn)化為數(shù)字信號(hào)，然后用SAM軟件（版本3.02）處理數(shù)據(jù)，篩選出UAP患者和正常對(duì)照者CD4+T淋巴細(xì)胞差異表達(dá)的miRNA。采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Real-time polymerase chain reaction，real timePCR)對(duì)部分差異表達(dá)的miRNA進(jìn)行驗(yàn)證。
　　結(jié)果:miRNA基因

9、芯片篩選結(jié)果顯示，相對(duì)于正常對(duì)照者，UAP患者外周血CD4+T淋巴細(xì)胞中表達(dá)顯著上調(diào)的miRNA有miR-155，miR-21，miR-424和miR-127-3p，顯著下調(diào)的有miR-30b和miR-181a。real time PCR進(jìn)一步驗(yàn)證的結(jié)果表明，上述差異表達(dá)miRNA的變化趨勢(shì)及變化倍數(shù)與miRNA基因芯片篩選結(jié)果一致。
　　結(jié)論:篩選得到的UAP患者循環(huán)血CD4+T淋巴細(xì)胞miRNA差異表達(dá)譜，可能與參與了UAP的

10、發(fā)生發(fā)展。
　　第二部分:miRNA-155對(duì)UAP患者CD4+T淋巴細(xì)胞亞群分化和功能的影響
　　目的:通過研究微小核糖核酸-155(miRNA-155)對(duì)UAP患者外周血CD4+T淋巴細(xì)胞的調(diào)控作用，從而揭示miRNA-155在UAP發(fā)病中的作用機(jī)制。
　　方法:選取入住我院的UAP患者10例，抽取新鮮外周靜脈血。采用密度梯度離心法分離出UAP患者PBMC，MACS法進(jìn)一步分離出CD4+T淋巴細(xì)胞，用無血清RPMI

11、1640培養(yǎng)基調(diào)整為2×106/ml，隨后分為四組:對(duì)照組、miRNA-155模擬體組和阻遏物組，以另一孔轉(zhuǎn)染熒光對(duì)照的FAM-siRNA作為熒光對(duì)照。對(duì)照組加入陰性對(duì)照的模擬體（終濃度為50nM），miRNA-155模擬體組中加入的為miRNA-155模擬體（終濃度為50nM），阻遏物組加入的miRNA-155模擬體和miR-155阻遏物（終濃度分別為50nM），同時(shí)加入脂質(zhì)體2000，共轉(zhuǎn)染5h。隨后加入植物凝血素刺激CD4+T淋巴

12、細(xì)胞活化后，收集細(xì)胞及上清。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CD4+T淋巴細(xì)胞Th1和Th2亞群數(shù)量，提取CD4+T淋巴細(xì)胞總RNA和蛋白，real time PCR檢測(cè)γ干擾素受體α鏈（Interferon-gamma receptor alpha chain，IFN-γRα）、T細(xì)胞表達(dá)的T盒(T boxexpressed in T cells，T-bet)、GATA結(jié)合蛋白3（GATA binding protein3，GATA-3）mRNA的表達(dá)

13、;蛋白免疫印跡法(Western blotting)檢測(cè)IFN-γRα、T-bet、GATA-3蛋白的表達(dá);酶聯(lián)免疫法(Enzyme-linked immunosorbentassay，ELISA)檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)液上清γ干擾素(Interferon-gamma，IFN-γ)、白細(xì)胞介素4(Interleukin-4，IL-4)的表達(dá)。對(duì)IFN-γRα與IFN-γ、 IL-4的表達(dá)進(jìn)行直線相關(guān)性分析。
　　結(jié)果:流式細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果顯示，

14、miRNA-155模擬體組的IFN-γ陽性CD4+T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)較對(duì)照組顯著增加[(63.19±8.61)％ vs(47.17±10.28)％，P＜0.01]，阻遏物組較miRNA-155模擬體組降低[(52.87±10.05)％ vs(63.19±8.61)％，P=0.024]。三組間IL-4陽性CD4+T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)無明顯差異(F=0.228，P=0.798)。與對(duì)照組比較，miRNA-155模擬體組T-bet mRNA表達(dá)顯著增加

15、(P＜0.01)，與miRNA-155組比較，阻遏物組T-bet mRNA表達(dá)降低(P＜0.01);三組間IFN-γRα、GATA-3的mRNA表達(dá)無明顯差異（分別F=1.055，P=0.362; F=1.601，P=0.220）。與對(duì)照組比較，miRNA-155模擬體組IFN-γRα蛋白表達(dá)顯著減少，T-bet蛋白表達(dá)顯著增加（均P＜0.01）;與miRNA-155模擬體組比較，阻遏物組IFN-γRα蛋白表達(dá)增加，T-bet蛋白表達(dá)減

16、少（均P＜0.01）;三組間GATA-3蛋白表達(dá)無明顯差異(F=0.098，P=0.907)。與對(duì)照組比較，miRNA-155模擬體組的IFN-γ顯著增高（P＜0.01），阻遏物較miRNA-155模擬體組降低（P＜0.01）;三組間IL-4表達(dá)無明顯差異(F=0.384，P=0.685)。相關(guān)分析表明，IFN-γRα蛋白表達(dá)與IFN-γ表達(dá)呈顯著負(fù)相關(guān)（r=-0.775，P＜0.01），與IL-4表達(dá)無相關(guān)關(guān)系（r=0.041，P=0

17、.832）。
　　結(jié)論:miRNA-155主要通過影響Th1細(xì)胞的分化和功能，參與對(duì)CD4+T淋巴細(xì)胞的調(diào)控，在UAP發(fā)病中起重要的作用。miRNA-155的作用可能部分與調(diào)控靶基因IFN-γRα的表達(dá)有關(guān)。
　　第三部分 CD4+T淋巴細(xì)胞異常表達(dá)miRNA-155與UAP患者介入治療術(shù)后心肌損傷的關(guān)系
　　目的:初步探討異常表達(dá)m iRNA-155與UAP患者在PCI術(shù)后心肌損傷關(guān)系，為進(jìn)一步闡明miRNA在PCI

18、術(shù)后心肌損傷機(jī)制中的作用提供理論基礎(chǔ)。
　　方法:選取2010年1月至12月入住我院并行PCI的UAP患者41例，其中PCI術(shù)后肌鈣蛋白升高超過正常參考值3倍20例，肌鈣蛋白正常者21例，同時(shí)以18例疑似不典型冠心病癥狀而冠脈造影正常的住院患者為正常對(duì)照組。Real time PCR檢測(cè)患者循環(huán)血CD4+T淋巴細(xì)胞miRNA-155在PCI術(shù)前和術(shù)后12h的表達(dá)水平，western blotting檢測(cè)術(shù)前和術(shù)后12h IFN-γ

19、Rα蛋白的表達(dá)，ELISA法測(cè)定PCI術(shù)前和術(shù)后12h血清IFN-γ和IL-4的表達(dá)。對(duì)miRNA-155的表達(dá)水平和IFN-γRα蛋白、血清IFN-γ和IL-4進(jìn)行相關(guān)性分析。
　　結(jié)果:UAP患者術(shù)前miRNA-155、IFN-γ明高于對(duì)照組（均P＜0.01），IFN-γRα蛋白表達(dá)低于對(duì)照組（均P＜0.01），IL-4表達(dá)無差異（均P＞0.05）。術(shù)前肌鈣蛋白陽性組miRNA-155、IFN-γRα蛋白和IFN-γ表達(dá)水平與

20、肌鈣蛋白陰性組無明顯差異（均P＞0.05）;術(shù)后12小時(shí)，肌鈣蛋白陽性組與肌鈣蛋白陰性組的miRNA-155、hsCRP、IFN-γ表達(dá)均顯著增高（均P＜0.05），且肌鈣蛋白陽性組較肌鈣蛋白陰性組增高更為明顯(P＜0.05);IFN-γRα蛋白表達(dá)顯著低于（均P＜0.01），肌鈣蛋白陽性組較肌鈣蛋白陰性組降低更為明顯(P＜0.01)。兩組術(shù)前、術(shù)后血清IL-4水平無明顯差異。術(shù)前、術(shù)后miRNA-155表達(dá)與IFN-γ呈顯著正相關(guān)（分

21、別r=0.649，P＜0.01;r=0.682，P＜0.01），與IFN-γRα蛋白表達(dá)呈顯著負(fù)相關(guān)（分別r=-0.536，P＜0.01;r=-0.592，P＜0.01），與IL-4無明顯相關(guān)關(guān)系（分別r=-0.165，P=0.303; r=0.107，P=0.506）。
　　結(jié)論:miRNA-155參與了UAP患者中Th1細(xì)胞活化及細(xì)胞因子IFN-γ分泌的調(diào)控過程;miRNA-155表達(dá)與PCI術(shù)后心肌損傷存在明顯的相關(guān)關(guān)系，m