雞精原干細胞體外培養(yǎng)及其誘導分化的研究.pdf

1、精原干細胞(spermatogonial stem cells，SSCs)是指位于睪丸精曲小管基膜上既能自我更新維持自身群體數(shù)量恒定，又能定向分化產(chǎn)生精母細胞的一類干細胞。由于SSCs在體外基因修飾、轉(zhuǎn)基因動物生產(chǎn)等方面比胚胎干細胞更具優(yōu)勢，SSCs逐漸成為干細胞研究領(lǐng)域的一個熱點。本研究探索了三種不同的飼養(yǎng)層，即睪丸支持細胞、雞胚成纖維細胞和雞胚肝細胞對SSCs體外培養(yǎng)的影響以及培養(yǎng)傳代后SSCs保持多能性的潛力；應(yīng)用特異性化學物質(zhì)定

2、向誘導雞胚SSCs向成骨細胞、神經(jīng)元樣細胞分化，并對各誘導劑的組合效果及適合濃度進行了比較。以期能為禽類SSCs的研究和利用提供參考資料，為醫(yī)學研究提供實驗素材。研究結(jié)果總結(jié)如下幾點： 1．分別以睪丸支持細胞、雞胚成纖維細胞和雞胚肝細胞作為飼養(yǎng)層，比較三種不同的飼養(yǎng)層對SSCs體外培養(yǎng)的影響。結(jié)果顯示：以雞胚成纖維細胞飼養(yǎng)層培養(yǎng)SSCs可傳至四代，每代的AKP陽性克隆率分別為45％、40％、36％和21％。以睪丸支持細胞為飼養(yǎng)層

3、進行培養(yǎng)時傳至三代，每代的．AKP陽性克隆率分別是40％、32％、和22％。而以雞肝細胞作為飼養(yǎng)層，SSCs未見有克隆形成，不能進行傳代培養(yǎng)，表明雞胚成纖維細胞適合作為SSCs的飼養(yǎng)層，而雞胚肝細胞不適合作為SSCs飼養(yǎng)層。 2．以地塞米松、β-甘油磷酸鈉、維生素C為誘導劑，誘導雞胚SSCs向成骨細胞分化，比較以上各種誘導劑不同濃度和不同組合形成的誘導液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ，對傳代后SSCs的誘導分化效果，鈣結(jié)節(jié)Von Kossa’s

4、法、改良的鈣鈷法及免疫組化法對成骨細胞進行鑒定，實驗結(jié)果顯示：誘導分化液Ⅱ+Ⅲ的誘導分化效果最好，誘導分化率為85％，與單獨使用誘導分化液Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ的差異顯著(p<0.01)，但與單獨使用誘導液I的差異不顯著(P>0.05)，其誘導效果略好于單獨使用誘導液Ⅰ(誘導分化率為83％)。SSCs被誘導15-21天后分化為成骨細胞，誘導后的細胞Von Kossa’s染色可見細胞間布滿黑色顆粒，提示有礦化基質(zhì)沉積；改良鈣鈷法堿性磷酸酶染色胞漿呈深

5、棕色或深黑色，免疫組化法染色細胞呈陽性。 3．以維甲酸(RA)、BHA、3-異丁基-1-甲基黃嘌呤(IBMX)為誘導劑，誘導SSCs向神經(jīng)元樣細胞分化，比較以上各種誘導劑不同濃度和不同組合形成的誘導液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ，對傳代后SSCs的誘導分化效果，甲苯胺藍染色和免疫組化進行鑒定。結(jié)果顯示：誘導分化劑Ⅰ(RA)和誘導分化劑Ⅱ(IBMX)的誘導分化效果最好，誘導分化率分別為83％、81％，兩者之間無顯著差異(P>0.05)，但與其他誘導分化