清醒自由移動(dòng)動(dòng)物光栓缺血造模及相應(yīng)行為學(xué)檢測(cè).pdf

1、缺血性中風(fēng)是一類由腦部供血不足引起腦組織和腦功能損傷的疾病。缺血性中風(fēng)動(dòng)物模型尤其是在清醒動(dòng)物中制作疾病模型以及行為學(xué)檢測(cè)，早已成為基礎(chǔ)研究和新藥研發(fā)的重要組成部分。過(guò)去主流的缺血性中風(fēng)動(dòng)物模型多在麻醉動(dòng)物上造模，相應(yīng)的行為學(xué)檢測(cè)結(jié)果并不穩(wěn)定?；诖耍菊撐牡难芯抗ぷ髦铝τ诮⒁环N在清醒自由移動(dòng)動(dòng)物上，利用光化學(xué)栓塞方法制造缺血性中風(fēng)的動(dòng)物模型，并進(jìn)行實(shí)時(shí)的行為學(xué)檢測(cè)。
　　過(guò)去主流的缺血性中風(fēng)動(dòng)物模型，如頸總動(dòng)脈閉合、大腦中動(dòng)脈

2、閉合等，都是在麻醉?xiàng)l件下通過(guò)急性手術(shù)進(jìn)行缺血性中風(fēng)的模型制作，并隨即進(jìn)行行為學(xué)檢測(cè)。由于動(dòng)物需要至少7天才能從麻醉和手術(shù)中康復(fù)，這種研究策略就帶來(lái)了許多難以控制的因素，比如麻醉劑對(duì)缺血和神經(jīng)損傷的影響，手術(shù)過(guò)程中的應(yīng)激對(duì)缺血和神經(jīng)損傷的影響，以及缺血本身對(duì)手術(shù)后康復(fù)的影響等等。另外，絕大多數(shù)的人類缺血性中風(fēng)均不可能發(fā)生在麻醉和手術(shù)條件下，因此在麻醉動(dòng)物上建立的缺血性中風(fēng)模型不能有效地反映病人的情況。這也是為什么過(guò)去幾十年來(lái)幾十種新藥在中

3、風(fēng)動(dòng)物模型中有效，但在臨床試驗(yàn)中失敗的根本原因。因此，國(guó)際STAIR（Stroke Therapy Academic Industry Roundtable）標(biāo)準(zhǔn)最新推薦，必須要在清醒動(dòng)物中進(jìn)行缺血模型制作，才能準(zhǔn)確地評(píng)價(jià)治療中風(fēng)藥物的有效性。
　　為解決這些問(wèn)題，我首先在清醒自由移動(dòng)小鼠上建立了缺血性中風(fēng)模型。在麻醉?xiàng)l件下，利用腦立體定位儀把光纖導(dǎo)管埋植到小鼠海馬腦區(qū)。手術(shù)后讓動(dòng)物恢復(fù)7天，直到動(dòng)物可以正?；顒?dòng)時(shí)，再進(jìn)行光栓缺血

4、造模。腹腔注射玫瑰紅(100mg/kg)后讓動(dòng)物吸收1小時(shí)，將光纖插入光纖導(dǎo)管，分別給予不同光源照射30分鐘。24小時(shí)后用TTC（2，3，5-Triphenyltetrazolium chloride）染色檢測(cè)缺血損傷程度，發(fā)現(xiàn)在這種條件下，473 nm激光照射30分鐘造模效果最佳。
　　接下來(lái)，利用這種方法，在清醒小鼠初級(jí)運(yùn)動(dòng)皮層進(jìn)行光栓缺血造模并檢測(cè)其運(yùn)動(dòng)能力。主要采用轉(zhuǎn)棒(rotarod)和踏步測(cè)試(rung walk)來(lái)檢

5、測(cè)缺血發(fā)生前后小鼠的運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)性和平衡能力。在小鼠單側(cè)初級(jí)運(yùn)動(dòng)皮層埋管7天后，動(dòng)物得到很好康復(fù)。光栓缺血造模前訓(xùn)練小鼠進(jìn)行轉(zhuǎn)棒和踏步測(cè)試。經(jīng)過(guò)兩天的訓(xùn)練得到動(dòng)物運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)性和平衡能力的基本數(shù)據(jù)。第三天，進(jìn)行勻速轉(zhuǎn)棒測(cè)試的同時(shí)在小鼠單側(cè)運(yùn)動(dòng)皮層光照造模:腹腔注射玫瑰紅（100 mg/kg）1小時(shí)后，將光纖插入小鼠單側(cè)初級(jí)運(yùn)動(dòng)皮層，然后將小鼠放在轉(zhuǎn)棒儀上進(jìn)行勻速轉(zhuǎn)棒測(cè)試，同時(shí)給予30分鐘473 nm光照。光照前10分鐘，小鼠腹腔注射尼莫地平(1

6、5 mg/kg，抗缺血藥物)或空白溶劑（10 ml/kg）。接下來(lái)進(jìn)行連續(xù)6天的轉(zhuǎn)棒和踏步測(cè)試。光照后第1天、第7天分別用跑步機(jī)檢測(cè)小鼠的運(yùn)動(dòng)耐力。在光栓缺血造模后的不同時(shí)間點(diǎn)（15分鐘、1天、3天、7天），選取一些小鼠進(jìn)行TTC染色，檢測(cè)缺血損傷隨時(shí)間的變化。研究發(fā)現(xiàn)不論是腦組織缺血還是運(yùn)動(dòng)能力的損傷，最早出現(xiàn)在光照結(jié)束后第15分鐘，24小時(shí)后損傷加重;3天后開(kāi)始恢復(fù)，并最終在光照后第7天得以基本恢復(fù)。此外，在現(xiàn)有范式中，尼莫地平能夠

7、促進(jìn)光栓缺血后神經(jīng)損傷的修復(fù)過(guò)程。
　　然后，我與周恒博士研究生合作，把這一技術(shù)方案應(yīng)用于清醒自由移動(dòng)的Sprague Dawley(SD)大鼠，檢測(cè)海馬和杏仁核光栓缺血對(duì)背景條件恐懼記憶不同加工階段的影響。首先驗(yàn)證了在SD大鼠上也能成功造模。在光栓缺血造模后5小時(shí)、24小時(shí)和7天分別取腦制作腦片進(jìn)行TTC染色或是電生理檢測(cè)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不論是杏仁核還是海馬，在光栓缺血造模后5小時(shí)就已經(jīng)產(chǎn)生較嚴(yán)重的神經(jīng)損傷，24小時(shí)后損傷最顯著，7

8、天后又能夠部分恢復(fù)。接下來(lái)，通過(guò)事先埋植光纖導(dǎo)管，待動(dòng)物恢復(fù)后，在恐懼記憶訓(xùn)練前5小時(shí)、訓(xùn)練后立刻和提取前5小時(shí)分別在清醒大鼠的海馬和杏仁核進(jìn)行光栓缺血造模，檢測(cè)相應(yīng)腦區(qū)光栓缺血對(duì)恐懼記憶的學(xué)習(xí)、鞏固和提取的影響。結(jié)果顯示，海馬缺血降低了恐懼記憶的提取成績(jī);杏仁核缺血既干擾記憶的鞏固又損傷記憶的提取。此外，訓(xùn)練前5小時(shí)在海馬或杏仁核進(jìn)行光栓缺血造模，動(dòng)物的學(xué)習(xí)能力和短時(shí)程記憶都不受影響。但是，訓(xùn)練前5小時(shí)同時(shí)在海馬和杏仁核造模，動(dòng)物的學(xué)

9、習(xí)能力和短時(shí)記憶都受損。
　　最后，我還探索了在靈長(zhǎng)類動(dòng)物樹(shù)鼩上建立光栓缺血模型。初步結(jié)果顯示，這一方法也能在樹(shù)鼩海馬中成功地誘導(dǎo)出缺血損傷。
　　總之，這種光栓缺血的技術(shù)方法，不僅能夠在清醒自由移動(dòng)的動(dòng)物中進(jìn)行中風(fēng)模型制作，也能進(jìn)行實(shí)時(shí)的行為學(xué)評(píng)價(jià)和藥物干預(yù)有效性評(píng)價(jià)，為缺血性中風(fēng)相關(guān)的基礎(chǔ)研究和治療缺血性神經(jīng)損傷的新藥研發(fā)提供全新的方法。用這一新的技術(shù)方法進(jìn)行缺血性中風(fēng)模型制作和行為學(xué)評(píng)價(jià)，目前還未見(jiàn)任何報(bào)道，具有顯著的