骨髓動員治療糖尿病大鼠后肢缺血的研究.pdf

1、目的：糖尿病能損害血管內(nèi)皮細(xì)胞從而引起微血管病變閉塞，糖尿病動脈硬化閉塞癥的發(fā)病率是非糖尿病的11倍，且周圍動脈硬化發(fā)展快，程度重，范圍廣。由于糖尿病主要引起下肢遠(yuǎn)端微小血管的病變閉塞，常失去手術(shù)治療機會，易引起下肢遠(yuǎn)端缺血而致壞疽。
　　 “治療性的血管形成” 目前已被廣泛接受，已有報道采用成纖維細(xì)胞生長因子(FGF)或血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(VEGF)基因直接注射治療糖尿病肢體缺血或者移植自體骨髓干細(xì)胞治療糖尿病肢體缺血，前者

2、由于基因治療的安全性而受到質(zhì)疑，而后者對于單純移植CD34+細(xì)胞還是多種干細(xì)胞一起移植仍在爭論中。本研究采用自體骨髓動員以觀察單純骨髓動員對糖尿病大鼠肢體缺血的作用。
　　 本研究旨在：1 通過動物實驗復(fù)制動物(SD大鼠)糖尿病模型及后肢缺血模型，通過毛細(xì)血管密度的改變觀察骨髓動員治療糖尿病大鼠肢體缺血的療效。2通過骨髓動員前后血CD34+細(xì)胞和白細(xì)胞的含量變化，觀察大鼠肢體急性缺血后是否存在骨髓干細(xì)胞動員狀態(tài)。3通過內(nèi)皮功能動

3、態(tài)的監(jiān)測，觀察骨髓動員對糖尿病大鼠全身血管病變的影響。
　　 方法：實驗對象SD大鼠25只，雄性，8周齡，體重180-250克之間，制備糖尿病大鼠后肢缺血模型，隨機分為2組，其中15只進行骨髓動員(A組)，其余10只不進行骨髓動員，為空白對照組(B組)。骨髓動員后及動員后3天從A、B兩組大鼠內(nèi)眥靜脈取血用流式細(xì)胞計數(shù)儀檢測WBC和CD34+細(xì)胞。骨髓動員前及動員后第2、4周于內(nèi)眥靜脈取血檢測ET和NO水平，動員后第4周取雙后肢肌

4、肉做病理檢查，檢測毛細(xì)血管密度觀察骨髓動員治療糖尿病大鼠肢體缺血的療效。
　　 1 糖尿病大鼠模型的制備
　　 大鼠禁食12小時后，按65mg/kg劑量一次性腹腔注射1[％]鏈脲佐菌素(STZ)1.5-2ml,給藥72小時后連續(xù)兩次通過尾靜脈采血，檢測空腹血糖＞16.65mmol/L作為糖尿病大鼠模型。
　　 2 糖尿病大鼠后肢血管病變模型的制備
　　 麻醉大鼠后，取其雙側(cè)腹股溝韌帶至膝關(guān)節(jié)上下各行一縱行

5、缺口，分離、結(jié)扎、離斷股動脈及其分支。觀察3天，手術(shù)后肢逐漸萎縮，活動力下降，無壞疽，為糖尿病大鼠后肢血管病變模型的制備成功。
　　 3 骨髓動員
　　 糖尿病后肢缺血模型制備成功后，A組皮下注射粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF，150ug.kg-1.d-1),同時B組每天皮下注射生理鹽水1ml/d,連續(xù)3天。繼續(xù)飼養(yǎng)大鼠4周。
　　 4 外周血WBC和CD34+細(xì)胞計數(shù)
　　 動脈離斷術(shù)后當(dāng)天從A、B兩組

6、大鼠內(nèi)眥靜脈取血0.5ml,同法骨髓動員3天后以上大鼠各取血0.5ml，采用Ficoll液離心制備外周血單個核細(xì)胞，F(xiàn)ITC-CD34+單抗標(biāo)記后用流式細(xì)胞計數(shù)儀檢測WBC和CD34+細(xì)胞。
　　 5 血管內(nèi)皮功能生化指標(biāo)的測定
　　 血漿一氧化氮(NO)采用硝酸還原酶法測定，單位：umol/L。血漿內(nèi)皮素(ET)采用放射免疫分析法測定，單位：pg/ml。
　　 6 注射部位肌肉中毛細(xì)血管密度的測定
　　

7、 常規(guī)方法制備大鼠肌肉光鏡組織切片，行蘇木素-伊紅(HE)染色,免疫組織化學(xué)法行CD34染色進行毛細(xì)血管密度的測定。
　　 7 統(tǒng)計學(xué)處理
　　 所有數(shù)據(jù)用SPSS13.0軟件處理，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間差異用兩樣本均數(shù)的t檢驗進行比較，實驗前后用配對資料t檢驗進行比較，兩組以上比較采用單因素方差分析。顯著性用P值表示，P＜0.05為差異有顯著性，P＜0.01為差異有極顯著性。
　　 結(jié)果：
　　

8、 1 實驗動物觀察
　　 雙側(cè)股動脈離斷后3天大鼠缺血后肢逐漸萎縮，活動力下降，所有動物在處死取材時局部均無明顯壞疽。
　　 2 流式細(xì)胞儀檢測WBC和CD34+細(xì)胞結(jié)果顯示:
　　 A組動脈切除術(shù)后當(dāng)天(n=15)WBC和CD34+細(xì)胞分別為(7.37±1.36)×109/L和(0.15±0.04)[％],動員3天后，(n=15)WBC和CD34+細(xì)胞分別為(22.53±2.44)×109/L和(2.27±0

9、.38)[％]，明顯高于動員前(P＜0.05)，說明肢體缺血和G-CSF動員能明顯提高外周血WBC和CD34+細(xì)胞含量。B組動脈切除術(shù)后當(dāng)天(n=10)WBC和CD34+細(xì)胞分別為(7.38±1.15)×109/L和(0.16±0.05)[％]，未行動員3天后，(n=10)WBC和CD34+細(xì)胞為(9.82±1.40)×109/L和(0.45±0.10)[％]，CD34+細(xì)胞比例明顯增高(P＜0.05)，說明肢體缺血能明顯提高外周血WB

10、C和CD34+細(xì)胞含量。但A組比B組外周血WBC和CD34+細(xì)胞比例增幅差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，說明G-CSF動員能明顯提高外周血WBC和CD34+細(xì)胞含量。
　　 3 血漿NO和ET水平的測定
　　 A組和B組動員前NO水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，動員后第2周、第4周A組NO水平均高于B組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。A組與B組動員前ET水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，A組和B組各期ET

11、水平比較無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。
　　 4 毛細(xì)血管密度的測定
　　 A組CD34染色陽性的毛細(xì)血管密度為4.9±1.6個，高于B組3.7±1.8個，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05).
　　 結(jié)論：
　　 1大鼠肢體急性缺血后，存在骨髓干細(xì)胞動員狀態(tài)，外周血CD34+細(xì)胞升高。
　　 2 骨髓干細(xì)胞動員劑G-CSF可以明顯擴大肢體缺血對干細(xì)胞的動員效應(yīng)，使外周血CD34+細(xì)胞數(shù)目遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于非動